近年来水温作为环境科学重要研究领域,科学家关注温度对生物的环境效应越来越普遍。鱼类是典型的变温动物,其生存、生长及行为都与温度有着较为密切的关系。低温不仅影响鱼类的生命活动,例如鱼类的体型,运动,呼吸;而且也打乱了新陈代谢过程,影响神经调节。因此,研究鱼类的抗寒性能称为一大热点。本研究紧紧围绕抗寒机制这一主题,利用斑马鱼ZF4单克隆细胞系作为实验材料,研究单克隆细胞系能够避免不同细胞之间的差异性更好的反映细胞的性状及对寒冷的响应,充分揭示了个体适应寒冷环境的能力,前人对单细胞系研究较少,本实验作为一个新的亮点探索单细胞系对低温的适应性。本实验阐述了低温对细胞传代的影响,利用转录组学,初步明确斑马鱼单克隆耐低温相关的通路,阐明斑马鱼单克隆细胞的耐寒机理,具体如下:正常温度(T-28),细胞状态良好,细胞大小均一,细胞棱角清晰,核质明显,几乎没有漂浮的死细胞;低温(T-18),细胞略大于对照组正常温度细胞,细胞棱角不清晰,核质较暗,有死细胞存在;低温(T-13),13℃细胞比18℃细胞大,细胞的状态明显不如18℃细胞,细胞棱角更模糊,细胞大小不一,核质不清晰,死细胞存在明显。从传代角度分析,正常细胞传代过程中,细胞完全贴壁需12小时,传代3-4天为一代。初次细胞从28℃转入18℃,细胞初次传代12小时后,细胞贴壁仅为三分之一,3-4天几乎完全贴壁,细胞稳定性变差。在细胞驯化过程中发现,细胞驯化是长期逐步适应的过程,驯化后的细胞传代过程变稳定。实验探究发现了,在18℃传代到5代以上,细胞7天传代一次,细胞24小时后几乎全部贴壁,细胞的生长状态在驯化中,逐渐稳定;细胞在18℃稳定后再传入13℃的温度下,细胞两个月(60天)左右传代一次,7天左右贴壁一半,细胞的状态不稳定,发现13℃-3代细胞继续低温培养,细胞生长更加缓慢,甚至继续传代会死亡。很明显发现,不同温度下,细胞的传代速率有显著的差别,温度越低,细胞的传代速率越低,从而导致细胞的生长速率越慢。之后我们将18℃驯化组细胞和28℃未驯化组细胞放置13℃低温处理3 d后,观察低温对驯化细胞和未驯化细胞的影响。我们发现18℃驯化细胞的形态与18~13℃3 d处理组没有明显差别,并且细胞能正常生长,稳定传代,说明驯化后的细胞对低温已经产生了适应性。随后我们比较了18℃低温驯化组和28℃未驯化组的细胞形态发现,在13℃处理3 d后,驯化组细胞连接较为紧密,整体状态未发生太大变化;而28℃未驯化组细胞聚集程度非常明显,细胞状态较差,死细胞数目增多。我们对细胞的存活率,ROS含量及细胞的凋亡程度进行检测发现,18℃驯化组细胞存活率高于28℃未驯化组(p<0.05),ROS含量显著低于28℃未驯化组(p<0.01),凋亡程度显著低于未驯化组(p<0.01),说明低温驯化能提高细胞的耐寒能力,在面临更低温度时,能减少ROS含量减轻细胞受损程度。差异表达基因筛选统计,G1群组中,总DEGs为3,754,上调基因1,599,下调基因2,155;G2群组中,总DEGs为3,647,上调基因2,198,下调基因1,449。GO富集分析13℃组中,生物学过程(BP)主要集中在“organic acid metabolic process”,“oxoacid metabolic process”,“carboxylic acid metabolic process”,“small molecule biosynthetic process”,“organophosphate biosynthetic process”,“small molecule catabolic process”,“cofactor metabolic process”。18℃组中,生物学过程(BP)主要集中在“DNA metabolic process”,“DNA repair”,“cellular response to DNA demage stimulus”,“cell cycle process”,“DNA replication”,“mitotic cell cycle process”,“double-strand break repair”,“DNA recombination”,“nuclear division”,“DNA-dependent DNA replication”。KEGG聚类分析发现,18℃这一组,主要集中在“Pyrimidine metabolism”,“Homologous recombination”,“DNA replication”,“Mismatch repair”,“Fanconi anemia pathway”,“Drug metabolism-other enzymes”,“P53 signaling pathway”。13℃这一组中,主要集中在“MAPk signaling pathway”,“Endocytosis”,“Adherens junction”,“AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication”。DNA复制,细胞周期,吞噬作用,错配修复,凋亡和细胞衰老这六个通路的上调基因和下调基因的分布,18℃在细胞周期,细胞衰老,DNA复制和错配修复上调基因数量相对比13℃多,而13℃在吞噬作用和凋亡上调基因数量相对比18℃多,说明18℃细胞能适应低温的环境是因为自身的复制修复机制积极配合,13℃细胞这些机制比较弱,更多触发的是凋亡,死亡程序,也解释了细胞在13℃适应性差。综合上述总之,本研究成功建立了低温驯化细胞系,为今后抗寒机制的研究提供了实验材料,同时也为低温适应机制的进化历程追踪提供了研究基础。细胞通过长期适应低温环境,细胞逐步产生了对一定温度范围内低温适应,解释了细胞在18℃更容易生长,稳定传代。同时转录组数据结果分析修复机制与凋亡系统的相互配合,维持生长和死亡的平衡,有利于细胞在低温的存活。