背景和目的冠状动脉闭塞由病变血管粥样斑块内或内膜下出血、管腔内血栓形成或动脉持久性痉挛,使管腔发生完全或不完全的闭塞,导致心脏灌注不足,使得心脏组织的缺血,可破坏心肌细胞而引起的心肌梗死。心肌细胞对于维持心脏功能是至关重要的。成熟的心肌细胞处于终末分化状态,永久性地退出细胞周期,几乎没有再生能力,无法实现心肌损伤后的自我修复。哺乳动物心脏损伤发生后主要反应是心肌纤维化、非收缩性疤痕组织的形成,使心脏功能受损,最终导致心衰发生。因此,促进退出细胞周期的心肌细胞再次进入细胞周期,补充丢失的心肌细胞,是实现心肌再生的关键(1)。在胚胎早期,小鼠心肌细胞的增殖水平很高,从胚胎第10-12天附近细胞增殖水平开始下降。出生后第2周,许多心肌细胞发生“细胞质不分裂”有丝分裂,产生双核心肌细胞。之后大多数心肌细胞处于细胞周期停滞状态(2,3)。近年在成年哺乳动物的心脏中发现存在心肌细胞增殖现象(4)。然而,心肌细胞增殖能力极其有限,且远不足以恢复损伤后的心脏功能(5,6)。目前有关出生后阶段如何发生不可逆的细胞周期停滞机制尚不清楚。因此,通过分析新生及成年心肌细胞的细胞周期活性之间的差异,了解心肌细胞周期的基本机制,将有助于促进心肌细胞大量增殖,恢复缺血性心血管疾病引起的心脏功能损害。MicroRNAs(miRNAs)是一类约含22个核苷酸的单链小分子RNA,(7)。miRNAs通过与靶向mRNAs的3-非编码(3’UTR)靶向识别结合,诱导的目标mRNAs沉默,在转录后水平发挥调节基因表达的作用。研究发现,miRNAs可参与心脏的发育及功能的完善,对心肌细胞增殖和成熟有着关键作用(7-9)。既往体外实验验证,let-7i具有强烈抑制心肌细胞增殖的功能。然而,它是否在体内对心肌细胞发挥相同功能及具体作用机制尚不清楚。我们通过生物信息学技术,预测到CCND2、E2F2是let-7i的潜在的靶基因。CCND2、E2F2是细胞周期调节因子,其异常表达可致细胞增殖异常。因此我们猜测let-7i通过调节细胞周期,调控心肌细胞增殖。在本研究中,我们将通过在体内过表达/敲低let-7i的表达量并在成年小鼠心梗模型上进行验证。方法1.新生1天龄、7天龄和10天龄乳鼠心肌细胞let-7i表达量的差异分析A.体外分离及培养出生后1天、7天以及10天的乳鼠心室心肌细胞。B.实时定量PCR验证let-7i差异性表达于不同鼠龄的心肌细胞。2.探索在新生1天乳鼠小鼠体内过表达let-7i是否抑制心肌细胞增殖。A.新生1天乳鼠小鼠左心室心肌内注射腺相关病毒(Ad-let-7i/Ad-NC),过表达let-7i表达量,免疫荧光标记增殖核抗原(EdU,pH3)检测心肌细胞增殖的情况。B.新生1天乳鼠小鼠左心室心肌内注射腺相关病毒(Ad-let-7i/Ad-NC),过表达let-7i表达量,免疫荧光标记细胞边界(WGA),检测敲低let-7i是否对心肌细胞的肥厚产生影响。3.探索在成年小鼠体内敲低let-7i是否促进心肌细胞增殖。A.成年小鼠左心室心肌内注射腺相关病毒(AAV-anti-let-7i/AAV-NC),敲低let-7i表达量,免疫荧光标记增殖核抗原(EdU,pH3)检测心肌细胞增殖的情况。B.成年小鼠左心室心肌内注射腺相关病毒(AAV-anti-let-7i/AAV-NC),敲低let-7i表达量,免疫荧光标记细胞边界(WGA),检测敲低let-7i是否促进心肌细胞的肥厚。4.探索敲低let-7i是否促进心肌梗死后心肌再生及改善心功能。A.制备成年小鼠心梗模型,心肌梗死边缘区局部注射AAV-anti-let-7i/AAV-NC,免疫荧光标记细胞增殖核抗原检测(EdU,pH3)梗死周边区心肌细胞增殖,免疫荧光标记细胞膜检测(WGA)梗死周边区心肌细胞直径变化;B.M型超声观察心功能变化及masson染色观察心肌纤维化程度。5.探索let-7i调控心肌再生的分子机制。A.生物信息学预测let-7i可能结合的mRNA;B.荧光素酶基因报告系统、免疫荧光素酶及蛋白免疫印迹试验验证。结果1.let-7i的表达量随着鼠龄的增加而增加。2.在体内过表达let-7i表达抑制心肌细胞增殖,抑制let-7i表达可以促进心肌细胞增殖。3.在体内抑制let-7i的表达后,可以促进心肌梗死后的心脏功能的恢复。4.let-7i作用于CCND2、E2F2,调节心肌细胞细胞周期,调控心肌细胞增生。结论let-7i靶向作用于CCND2、E2F2,调节心肌细胞细胞周期,调控心肌细胞增生,影响心肌梗死后心脏功能恢复。