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目的1、将不同浓度的维生素K2(VK2)、黄连素分别作用于肝癌Hep-G2细胞株,以初步探讨其抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用及机制。2、将黄连素与维生素K2配比混合,然后干预肝癌Hep-G2细胞株,以进一步研究两药联合是否更大程度增强对肝癌细胞增殖的抑制效果。3、根据实验结果分析黄连素作为中药提取物,是否具有增强维生素K2疗效的作用,以深入探讨上述中药在肝癌治疗中的作用。方法 CCK-8法检测VK2、黄连素对Hep-G2细胞增殖的抑制作用,取VK2、黄连素干预细胞48h后的半数抑制浓度IC50值,并将两个IC50值相加作为联合组的最终药物浓度;流式细胞术检测VK2、黄连素及两药联合干预细胞后对细胞、增殖及凋亡的影响;蛋白印迹法(Western blotting)及实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测VK2、黄连素及两药联合干预细胞后,抗增殖基因BTG2及细胞周期蛋白Cyclin D1的mRNA及蛋白表达情况。结果1、VK2可以抑制肝癌Hep-G2细胞的增殖,且这种抑制作用随着VK2浓度增加及作用时间的延长而增强,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01);VK2将细胞周期阻滞在G1期,并促进细胞凋亡,且凋亡率与VK2作用时间成正比(P<0.05);BTG2蛋白的表达随着VK2作用时间的延长而逐渐升高,同时细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白的表达则随着VK2作用时间的延长而逐渐降低。与对照组相比,BTG2和CyclinD1蛋白表达的差异具有显著性(P<0.01);BTG2 mRNA的表达并没有随着VK2作用时间的延长而出现明显变化(P>0.05),且与对照组相比,差异不明显(F=0.30,P=0.83),但是,CyclinD1 mRNA的表达则随着VK2作用时间的延长而逐渐下调(P<0.01),与对照组比较,差异明显(F=415.6,P<0.01)。2、黄连素能够抑制肝癌Hep-G2细胞的增殖,而且这种抑制作用会随着黄连素浓度的增加及作用时间的延长而增强,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);黄连素可将细胞周期阻滞在G1期,并进一步促进细胞凋亡,且凋亡率与黄连素的作用时间成正比(P<0.05);BTG2蛋白的表达随着黄连素作用时间的延长而逐渐升高,同时细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白的表达则会随着黄连素作用时间的延长而逐渐下降,与对照组相比,BTG2和CyclinD1蛋白表达的差异均具有显著性(P<0.01);BTG2 m RNA的表达随着黄连素作用时间的延长出现逐渐增强的趋势,但差异不明显(P>0.05),且与对照组相比,差异不显著(P>0.05);而CyclinD1 mRNA的表达则随着黄连素作用时间的延长而逐渐减弱(P<0.05),与对照组相比,差异具有显著性(P<0.01)。3、将两种药物混合后干预肝癌Hep-G2细胞,发现三种药物浓度对细胞的抑制率随着时间延长而呈现逐渐上升趋势。进一步分析显示联合组与VK2组、黄连素组对细胞抑制率相比,差异具有明显的统计学意义(P<0.01);联合组仍然将细胞周期阻滞在G1期,具有促进细胞凋亡的作用,且凋亡率与联合组的作用时间成正比(P<0.05)。进一步分析可见三组药物干预细胞后,G0/G1期的细胞比例逐渐上升,S期细胞比例逐渐下降,G2期细胞比例变化不明显。BTG2蛋白的表达随着联合组作用时间的延长而呈现明显升高趋势(P<0.01),同时细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白的表达虽在24h-48h时降低不明显(P>0.05),但其他时间段其表达降低明显(P<0.01),总体趋势是随着联合组作用时间的延长而逐渐降低。与对照组相比,BTG2和CyclinD1蛋白表达的差异均具有显著性(P<0.01);BTG2 mRNA的表达从24h-72h并没有显示出时间依赖性,但与VK2组、黄连素组相比,其表达在每个时间段明显上升(P<0.01),与对照组相比,差异明显(P<0.01)。CyclinD1 mRNA的表达在24h-48h时间段下降不明显(P>0.05),其他时间段则明显下降(P<0.01),总体趋势是随着联合组作用时间延长,其表达逐渐降低,与对照组相比,差异明显(P<0.01)。结论1、VK2、黄连素均能够抑制肝癌Hep-G2细胞增殖,促进细胞凋亡,且具有时间依赖性。2、将VK2与黄连素联合,对肝癌Hep-G2细胞增殖的抑制作用增强;3、VK2、黄连素均能为肝癌的治疗提供一种新的方式,但将两种药物混合,其疗效将更明显,用于肝癌的辅助治疗也不失为一种更好的方法。