论文部分内容阅读
随着经济发展和社会进程高速推进,我国人口结构也在向老龄化发展,女性生殖衰老是其中的一个重要话题。卵巢衰老(Ovarian aging)在临床上主要表现为卵巢储备功能减退(Diminished ovarian reserve,DOR)、早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)及对促排卵药物的卵巢低反应(Poor ovarian response,POR)。其会导致女性卵泡对于促排卵药物的反应性下降,产生卵母细胞数量减少;卵母细胞发育潜能下降,导致不孕症的发生。卵泡是卵巢基本功能单位,其中颗粒细胞(Granolusa cells,GCs)是包绕在卵母细胞周围的一层或多层支持细胞,在卵泡发育的每一环节中都起着极为重要的作用。卵巢颗粒细胞与卵母细胞之间具有广泛的交流,通过多种自分泌和旁分泌途径,在不同时空具有不同的作用。其生长参与卵泡的募集,凋亡调控了卵泡的闭锁。在卵巢衰老进程中,颗粒细胞也是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)等衰老相关因素的攻击对象,在卵巢衰老导致的女性不孕中扮演重要角色。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物RNA中含量最为丰富的碱基修饰,广泛存在于m RNA和lnc RNA中。其在不同阶段、不同组织、不同的病理生理状态过程中的修饰具有动态可逆性。RNA m6A参与许多生命进程,其在调控基因表达与翻译、RNA胞浆转运、RNA编辑与可变剪接、RNA稳定性和降解等方面扮演重要角色,具有重要的研究意义。许多研究表明,m6A与配子发生过程密切相关。但其在卵巢衰老的发展进程中扮演的角色尚不明朗。在本研究的第一部分,首先通过比色法检测了来自于衰老卵巢的颗粒细胞及对照组样本中的m6A修饰丰度,发现卵巢衰老病人的颗粒细胞中m6A修饰相对对照组异常增多。通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹(western blot)等实验检测样本中影响m6A修饰丰度酶的表达情况发现去甲基化酶FTO呈现下调表达,而ALKBH5、METTL3、METTL4、METTL14、KIAA1429表达无明显变化。同时,通过免疫组织化学、细胞免疫荧光等手段验证了FTO在卵巢颗粒细胞中的特异性表达。为了探究衰老卵巢中颗粒细胞FTO下调的原因,使用过氧化氢作为活性氧来源对细胞进行处理,证实了氧化应激这一衰老因素可以下调卵巢颗粒细胞中的FTO表达,并导致细胞中m6A修饰增多。同时,使用COV434和KGN两种细胞系建立了FTO敲低的卵巢颗粒细胞模型,并探究FTO下调导致的m6A增多对颗粒细胞衰老的影响。点杂交实验(dot-blot)显示,敲低去甲基化酶FTO后细胞m6A修饰增多;β半乳糖苷酶染色及γHA.X染色显示敲低FTO的COV434和KGN细胞易于被过氧化氢诱导产生衰老表型。这一部分初步证实了m6A在衰老卵巢的颗粒细胞中具有异常表达,这一异常可能由衰老进程中活性氧导致的去甲基化酶FTO下调所引起,且该过程对于卵巢衰老相关的颗粒细胞功能有一定影响。本研究的第二部分探究了m6A修饰对于卵巢颗粒细胞的影响机制。为了探究其在卵巢颗粒细胞中的修饰靶点,首先对去甲基化酶FTO敲低的卵巢颗粒细胞及其对照组进行RNA甲基化测序(Methylated RNA immunoprecipitation sequening,Me RIP-seq)和转录组测序(m RNA sequening,m RNA-seq),筛选其中的靶点分子,发现m6A修饰增加且表达丰度发生显著改变的分子11个。通过Me RIP-q PCR、实时定量PCR等对细胞系样本进行再次验证;同时,通过慢病毒过表达FTO以验证两者之间的量化关系。初步确定了FOS是去甲基化酶FTO引起卵巢颗粒细胞功能变化关键的m6A修饰消减重要靶点。进一步通过实时定量PCR对15组分别来自衰老卵巢及对照组的颗粒细胞样本进行验证,证实了FTO与FOS间具有相关性,且FOS在卵巢衰老病人的颗粒细胞样本中显著上调。为了探究去甲基化酶FTO使FOS m RNA丰度升高的机制,使用放线菌素D对敲低FTO的颗粒细胞及其对照组进行了RNA转录抑制实验,并通过实时定量PCR对FOS-m RNA的丰度进行检测,发现FTO敲低的细胞相较对照组,FOS m RNA的半衰期延长,稳定性增加;同时,构建了FOS-3’UTR序列中m6A甲基化位点突变的双荧光素酶质粒及其野生型对照,对颗粒细胞系进行转染,检测突变型和野生型质粒的荧光变化,证明了FTO通过消减FOS m RNA-3’UTR的m6A修饰增强其稳定性这一过程。进一步通过加减法实验在细胞系中对FOS在卵巢颗粒细胞中的功能进行验证。发现使用小干扰RNA(si RNA)干扰FOS表达后,前期由于敲低FTO导致的衰老表型得到部分恢复。综上所述,卵巢衰老进程与m6A密切相关。这一进程可能由卵巢颗粒细胞中活性氧积蓄导致的去甲基化酶FTO的下调表达引起,其使FOS-m RNA-3’UTR的m6A修饰增多,进而使FOS丰度增加,最终导致卵巢颗粒细胞衰老加速,影响卵巢衰老进程。