目的:本试验以解淀粉芽孢杆菌B10为研究对象,对菌株中的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）降解酶进行分离和鉴定;同时对降解酶的降解特性和催化反应关键位点进行探究。旨在分离得到能够高效降解AFB1的降解酶,同时为日后通过酶工程学改造提高该酶稳定性和催化反应效率提供一定的理论依据,使其能够早日应用于动物生产实践之中。方法:本试验首先通过蛋白酶K处理,确定解淀粉芽孢杆菌B10培养上清中,具有AFB1降解活性的物质是否为某种蛋白。之后使用硫酸铵对培养上清中的蛋白进行梯度沉淀,经透析除盐后制备粗蛋白液。通过DEAE离子交换色谱对AFB1降解酶进行初步分离,再将最优降解组份通过凝胶过滤色谱进一步分离;最后经SDS-PAGE分离后,进行蛋白质质谱鉴定,以确定B10菌株中AFB1降解酶的氨基酸序列。使用AlphaFold2对该酶蛋白质结构进行建模,并与黄曲霉毒素进行分子对接研究,以分析该酶是否能催化黄曲霉毒素降解,并对与催化降解相关的氨基酸残基进行研究。从B10菌株中,尝试扩增降解酶基因,构建降解酶-pET-28a重组载体;经原核表达后,检测降解酶是否具有活性,并对其酶学特性进行研究。在不同培养时间、温度、pH值、金属离子和其他常见条件下,对降解酶的AFB1降解效率和降解活性进行研究。最后对降解酶的活性位点进行探究,并通过定点突变试验构建降解酶突变体,测定突变体的AFB1降解效率。结果:对培养上清通过蛋白酶K进行处理,首先确定了解淀粉芽孢杆菌B10中AFB1降解活性物质是某种酶。通过硫酸铵梯度沉淀培养上清中的蛋白,发现浓度为80%的硫酸铵粗提蛋白具有最佳的AFB1降解效率。粗提蛋白经DEAE离子交换色谱初步分离,和凝胶过滤色谱进一步分离,确定4-3组份降解活性最高,降解率为87.3%。最后经过SDS-PAGE分离、蛋白质质谱检测及分析匹配之后,初步判定B10菌株中具有AFB1降解活性的酶可能为漆酶。通过AlphaFold2对重组漆酶蛋白质结构进行预测,经拉氏图评估,97%的残基落在可允许的区间内,可用于分子对接研究。将6种黄曲霉毒素与B10漆酶预测模型进行分子对接,各黄曲霉毒素与B10漆酶均有较高的对接打分。B10漆酶Lys-153和Arg-268均与各黄曲霉毒素产生了氢键相互作用,这两个残基极有可能是结合毒素的关键氨基酸;此外,His-87均与各黄曲霉毒素产生了疏水性作用力。结果说明B10漆酶与黄曲霉毒素具有较强的结合能力,即有可能发挥AFB1降解特性。通过PCR扩增得到B10漆酶基因,并成功构建B10漆酶-pET-28a重组载体。B10漆酶与贝莱斯芽孢杆菌SRCM100072中漆酶结构域蛋白YImD同源性达99.64%。通过原核表达B10漆酶,经SDS-PAGE表现为明显且单一的条带,表观分子量约为35 kDa。通过对B10漆酶酶学特性研究发现,B10漆酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.5;在pH 5.0-8.5和30-50℃条件下,B10漆酶稳定性较好。通过测定B10漆酶的AFB1降解效率发现,随着孵育时间增长,AFB1降解率逐渐升高,反应36 h时AFB1降解率可达79.3%。通过测定不同条件对降解效果的影响,发现B10漆酶在pH 6.5时AFB1降解率最高,可达84.2%。温度从20℃-40℃,随着温度升高降解率逐渐升高,40℃时AFB1降解率可达82.4%。Ca2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+会显著降低B10漆酶的AFB1的降解活性（p＜0.001）,Na+,K+略显著降低其降解率（p＜0.05）;Mg2+虽然能略微提升降解率,但是对AFB1的降解活性并无显著影响。EDTA（p＜0.05）和SDS（p＜0.001）会显著降低重组漆酶的AFB1降解活性。值得注意的是添加DMSO后,AFB1降解效率显著提升（p＜0.05）。通过定点突变评估B10漆酶中H87、C132和H149残基的作用,发现单突变体H87（p＜0.001）、C132（p＜0.05）和H149（p＜0.001）能够显著降低B10漆酶的AFB1降解活性;AFB1降解率分别下降至54.2%、60.8%和56.8%。双突变体H87/C132、H87/H149、C132/H149的AFB1降解活性发生进一步降低。而三突变体H87/C132/H149的AFB1降解活性几乎完全丧失。结论:确定解淀粉芽孢杆菌B10中降解黄曲霉毒素的活性物质,包含一种新型漆酶;该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.5;在pH 5.0-8.5和30-50℃条件下,稳定性较好。B10漆酶在40℃,pH为6.5时表现出较高的AFB1降解活性,同时Mg2+和DMSO能够提高B10漆酶降解AFB1的效率;Lys-153、Arg-268、His-87、Cys-132和His-149残基在催化B10漆酶降解AFB1中发挥着重要的作用。