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RNA干扰是一种典型的序列特异的转录后基因表达调控方式,在生物进化过程中高度保守。宿主通过RNA干扰抑制病毒等外源核苷酸的表达,从而维护自身基因组的稳定性。RNA干扰技术是基于RNA干扰现象发展起来的一项新技术,通过人工导入一段与目的基因同源的双链RNA序列使其mRNA降解,表达缺失,实现基因敲除。RNA干扰具有高度的特异性以及很高的效率,和以往采用的反义技术相比,抑制基因表达的功能要强大得多。RNA干扰技术在基因和蛋白功能研究、传染病、肿瘤和遗传病的基因治疗领域显现出良好的应用前景。目前实验室进行RNA干扰常用的小干扰RNA(siRNA small interfering RNA)片段来源主要有两种,一是细胞外合成,二是细胞内合成,包括以质粒为载体的细胞内合成和以病毒为载体的细胞内合成。经改造的质粒和病毒为载体的小干扰RNA片段可较长时间在真核细胞内表达,为肿瘤的基因治疗开辟了新的途径。由于环境污染和吸烟等不良生活习惯,肺癌已经成为目前世界上发病率增长最快的恶性肿瘤之一。它的发病率在发达国家和我国的一些大城市占所有恶性肿瘤发病率的第一位。肺癌预后差,发现时多已转移,失去手术机会。化疗是肺癌治疗的主要手段,但是效果不能令人满意。癌细胞易产生耐药,使化疗失败。所以发现新的治疗手段是一项意义重大的工作。像其它许多恶性肿瘤一样,肺癌的发生发展是一个多基因参与的多步骤的过程,与一系列的基因表达失衡有关,其中凋亡抑制基因的过度表达而导致的细胞凋亡不足和增生过度是肺癌发生的重要原因。细胞凋亡又称为程序性细胞死亡,是一种基因控制的细胞自杀过程。细胞的凋亡过程受凋亡诱导因子(如Fas P53)和凋亡抑制因子(如Survivin bcl-2)共同调节。Survivin是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Proteins IAP)家族的成员,是IAP家族中分子量最小,功能最强的凋亡抑制蛋白。它是IAP家族中目前发现的唯一同细胞凋亡和周期调控都相关的成员,对肿瘤细胞的发生发展及其生物学特性的形成和维持都有非常重要的作用。Survivin在绝大多数肿瘤细胞中均高表达而在大多数正常组织不表达,而且抗凋亡功能强大,所以被认为是肿瘤基因治疗的理想靶点。Fas/FasL系统是细胞内最重要凋亡诱导系统之一。Fas(CD95/Apo-1)是319个氨基酸组成的糖基化受体蛋白,分子量36kd,属于肿瘤坏死因子/神经生长因子超家族,FasL是Fas的天然配体,也是一种跨膜蛋白。膜结合型FasL(mFasL)可被金属蛋白酶裂解,从膜表面脱落形成分子量较小的可溶性FasL(sFasL)。FasL和Fas结合激发传导系统级联反应,Fas胞质区的死亡结构域与胞质中衔接蛋白的死亡结构域结合形成二聚体,后者再以其分子中的致死效应结构域激活Caspase-8。有活性的Caspase-8切割其他无活性的Caspase原,使之成为有活性的异二聚体。再由有活性的Caspase切割其他凋亡的靶蛋白。虽然肿瘤细胞可以表达Fas/FasL,但肿瘤细胞凋亡率是下降的。这其中的原因之一是因为肿瘤细胞过度表达凋亡抑制蛋白。将凋亡诱导因子用于肿瘤的治疗一直是肿瘤研究的热点之一,而且已经得了一定的效果,如Trail(TNF-related apoptosis inducing ligand肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)在肿瘤动物模型的治疗试验中取得了令人满意的效果。但是将Fas/FasL这一细胞内重要的凋亡诱导系统用于肿瘤治疗却遇到很大的障碍,原因之一是其毒性较大,难以全身应用。在本研究中我们设想用RNA干扰技术敲除Survivin基因,以降低肺腺癌细胞A549的凋亡抗性,使其对凋亡诱导因子的敏感性增加,以期降低FasL的使用浓度,减少其毒性,为FasL用于临床肿瘤治疗探索一条可能的路线。第一章Survivin特异的小干扰RNA表达载体的构建目的构建凋亡抑制蛋白Survivin特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体。方法从Genbank上查阅Survivin基因的全长序列,设计Survivin特异siRNA转录模板,与PsilencerTM4.1-CMV neo连接形成重组质粒。氨苄青霉素平板筛选重组质粒。酶切和测序鉴定Survivin特异性小干扰RNA表达载体的正确性。结果经氨苄青霉素筛选,酶切和测序鉴定成功构建Survivin特异性小干扰RNA的表达载体。结论PsilencerTM4.1-CMV neo A可以和Survivin特异的小干扰RNA表达模板成功连接并且稳定地表达。第二章Survivin特异RNA干扰抑制Survivin基因表达目的用第一章所构建的凋亡抑制蛋白Survivin特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体转染肺腺癌细胞A549后使之稳定表达,检测其对Survivin基因表达的影响。方法Survivin特异性RNA干扰的表达载体经DNA测序鉴定后转染A549细胞,G418(Geneticin)筛选出稳定表达的单克隆细胞株,扩大培养。半定量以及荧光实时定量RT-PCR,免疫印迹(western blot)和免疫组织化学法检测Survivin基因mRNA和蛋白表达。结果Survivin特异性小干扰RNA表达载体转染后成功筛选出稳定表达Survivin-siRNA的肺腺癌细胞A549。Survivin基因mRNA表达下降76.4%,蛋白表达下降84.5%。免疫组织化学法也显示Survivin蛋白表达下降。结论Survivin-siRNA的表达载体转染肺腺癌细胞A549后可以降低A549细胞Survivin基因的表达。第三章Survivin特异的RNA干扰对肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的影响目的检测凋亡抑制基因Survivin特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体转染肺腺癌细胞A549后对细胞增殖和凋亡的影响。方法将转染后经G418(Geneticin)筛选出的稳定表达Survivin-siRNA,而且经RT-PCR,免疫印迹(western blot)和免疫组织化学法检测证实Survivin基因表达降低的A549细胞扩大培养,吖啶橙染色,荧光显微镜下观察肿瘤细胞的凋亡。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法连续5天检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果SiRNA组细胞增殖速度在各时间点较阳性对照组、阴性对照组及空白对照组细胞均明显下降,差异有显著性(P<0.01)。SiRNA组细胞凋亡率(10.09±1.31)%明显高于空白对照的(1.14±0.21)%、阳性对照组的(1.03±0.22)%和阴性对照组的(0.98±0.26)%。差异有显著性(P<0.01)。结论Survivin-siRNA的表达载体转染肺腺癌细胞A549后可以降低Survivin基因表达,抑制细胞的增殖,促进凋亡。第四章Survivin特异的RNA干扰增强肺腺癌细胞对可溶性FasL的敏感性目的探讨Survivin RNA干扰后肺腺癌细胞A549对可溶性FasL(sFasL)敏感性的改变。方法可溶性FasL作用于转染后稳定表达Survivin-siRNA,增殖速度下降凋亡率增加的A549细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果可溶性FasL作用于RNA干扰肺腺癌细胞,sFasL+siRNA组光密度值(D490)在各时间点与sFasL组、siRNA组和对照组相比下降,差异均有显著性(P<0.05),抑制率增加。而sFasL组(除48h)和siRNA组与对照组相比也下降,差异有显著性(P<0.05),抑制率增加。凋亡率(18.6±2.93)% )较单用siRNA组(10.09±1.31)%、sFasL组(10.12±2.31)%以及空白对照组(1.14±0.21)%明显增加,差异有显著性(P<0.01)结论Survivin RNA干扰后肺腺癌细胞对凋亡诱导因子可溶性FasL的敏感性增加。