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研究背景:妊娠期糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus,GDM)是妊娠期间发病率最高的疾病之一。GDM患者主要表现为胰岛素敏感性下降和胰岛素抵抗引起的糖耐量异常。但目前GDM的发病机制尚未完全阐明,尚无针对GDM的有效药物。临床和动物研究发现,肥胖是引起GDM发病的重要原因,而脂肪组织在其中扮演了重要角色。成纤维生长因子21(FGF21)是一种由肝脏分泌的代谢性激素,它通过作用于脂肪组织而发挥其调节血糖代谢和胰岛素敏感性的多效性。动物实验结果显示,FGF21能够诱导脂肪组织中脂联素(Adiponectin)的分泌,而且具有调节血糖、控制体重等改善代谢障碍的作用。因此,本课题旨在验证GDM患者中FGF21调节脂肪组织下游信号表达和Adiponectin分泌的功能是否发生改变,对于深入揭示GDM发病的分子机制具有重要科学意义。研究目的:1.寻找GDM和糖耐量正常(Normal glucose tolerance,NGT)孕妇中存在差异性的代谢性激素;2.寻找FGF21、Adiponectin等代谢性激素和血糖、胰岛素、胰岛素抵抗系数(HOMA-IR)等糖耐量相关指标之间的相关性;3.阐明脂肪组织和妊娠期间糖耐量异常的相关性;4.揭示GDM孕妇的皮下白色脂肪组织(subcatanous white adipose tissue,sWAT)中FGF21下游信号障碍的功能和分子机制;基于以上研究目的,本课题的总体研究目标旨在为以FGF21和Adiponectin等代谢性激素为基础研发GDM的新药提供理论基础。研究方法:1.根据纳入标准和排除标准,通过临床招募103例GDM孕妇和402例NGT孕妇,并采集孕妇参加24-28周产检时的空腹血清,利用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)检测孕妇循环中FGF21和Adiponectin的水平。利用F检验和T检验对方差齐性和组间差异进行比较,若P<0.05,则认为两组间存在显著性差异。2.利用ELISA试剂盒检测入组孕妇外周血中胰岛素水平,结合患者的其他代谢相关指标,采用Pearson’s Correlation相关性分析方法对孕妇外周血中FGF21、Adiponectin和血糖、胰岛素、HOMA-IR等指标进行相关性分析;采用Partial Correlation相关性分析方法排除孕妇的孕前身高和年龄等GDM风险因素,再次进行相关性分析。若P<0.05,则认为存在显著相关性,相关性系数越接近1或-1,则认为相关性越强。3.运用Pearson’s Correlation分析方法分析孕前BMI和妊娠期间空腹血糖水平的相关性。招募参加剖腹产孕妇的皮下白色脂肪组织,运用病理组织学的方法采集和处理孕妇sWAT,观察sWAT的病理形态变化。4.通过临床招募的方式收集孕妇的sWAT,并运用蛋白定量(Western Blot,WB)、(Immunofluorescence,IF)和实时荧光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)等方法对sWAT进行FGF21下游信号的检测。利用脂肪组织体外培养技术,注射人源重组FGF21蛋白(recombinant human FGF21,rhFGF21)过表达脂肪细胞中FGF21水平,检测过表达FGF21后的脂肪组织中FGF21下游蛋白及转录水平,细胞培养液中Adiponectin水平。研究结果:1.寻找NGT和GDM孕妇外周血中存在差异的代谢性激素的临床研究与NGT孕妇相比,GDM患者的孕龄、孕前BMI、24-28周OGTT血糖水平、外周血中胰岛素水平和HOMA-IR均出现显著升高(P<0.05)。循环中FGF21表达显著升高(P<0.001),但Adiponectin的水平出现显著下调(P<0.001)。GDM孕妇血清中FGF21和Adiponectin的比值是NGT孕妇的三倍。FGF21/Adiponectin比值是诊断GDM的最佳指标(ROC=0.6641,95%CI 0.6033–0.7250;P<0.0001)。2.建立代谢性激素和糖耐量相关指标的相关性血清FGF21水平、血清FGF21/Adiponectin比值与空腹血糖、餐后1小时和餐后2小时血糖水平均呈显着正相关(P<0.001);血清Adiponectin比值与空腹血糖和餐后2小时血糖水平呈显着负相关(P<0.001)。整个队列和NGT队列中血清Adiponectin与空腹胰岛素和HOMA-IR呈显著负相关,但是GDM队列中并未有显著差异。当把年龄和孕前BMI作为控制变量后,FGF21,Adiponectin,FGF21/Adiponectin比值与24-28周OGTT的空腹血糖、餐后一小时血糖和餐后两小时血糖的相关性趋势与控制变量前一致。只有整个队列的血清Adiponectin与HOMA-IR有显著性差异,其他结果与控制变量前的差异均未体现。3.阐明脂肪组织在GDM发病中的病理组织学改变相对于NGT孕妇,GDM患者的脂肪组织形态出现显著增大。GDM孕妇的发病率和孕前肥胖、脂肪细胞增大存在显著相关性(P<0.001)。孕妇的孕前BMI和24周-28周OGTT的空腹血糖存在显著正相关(P<0.001)。4.鉴定GDM患者sWAT中存在异常的FGF21下游信号相对于NGT孕妇,GDM患者sWAT细胞膜上FGF21的受体FGFR1c和β-Klotho的蛋白和mRNA表达水平均出现显著降低。受体介导的FGF21下游信号pERK 1/2和Adiponectin的蛋白蛋白和mRNA表达水平同时出现显著下调。5.利用体外培养技术,揭示FGF21调节GDM患者sWAT的功能障碍机制GDM患者sWAT中rhFGF21诱导下游基因表达的水平出现显著下调,如Adiponectin和Glut-1。rhFGF21诱导的sWAT分泌到培养液中的Adiponectin水平在GDM患者中也出现显著降低。结论:1.GDM患者外周血FGF21、Adiponectin和FGF21/Adiponectin比值相对NGT孕妇出现显著差异。2.FGF21和Adiponectin与妊娠期间的血糖代谢具有密切且独立的关联。3.肥胖和脂肪组织的自然改变和GDM的发生存在密切联系。4.GDM孕妇sWAT中FGF21的下游信号出现障碍。5.GDM患者sWAT中的FGF21信号在体外培养条件下对人源FGF21重组蛋白应答发生障碍。综上所述,本课题的研究结果揭示:在正常妊娠期孕妇中,外周血的FGF21与白色脂肪细胞上的特异性膜蛋白FGFR1和β-klotho共受体结合,激活下游的ERK 1/2蛋白磷酸化、诱导Adiponectin转录和蛋白合成和调控Glut-1的转录。因此脂肪细胞和分泌的adiponecitn共同维持正常的血糖水平。但是,在GDM孕妇中,白色脂肪细胞的膜蛋白FGFR1和β-klotho水平显著减少,循环FGF21无法正常的结合特异性FGFR1和β-klotho共受体并发挥作用,导致外周血中FGF21水平异常升高、脂肪细胞内FGF21的下游信号ERK1/2蛋白磷酸化、adiponecitn转录水平和蛋白合成和Glut-1转录水平显著下调。因此,脂肪细胞功能障碍和过低的循环Adiponectin无法正常调节血糖,最后引起血糖水平的升高。