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黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge]为多年生豆科(Fabaceae)植物,其干燥根为常用滋补中药材,含有活性较强的三萜皂苷、黄酮类、多糖类、氨基酸、微量元素以及棕榈酸、羽扇豆醇等。但由于草原荒漠化以及乱采挖等原因,药用野生黄芪资源已十分贫乏,即使采用人工栽培的方法不仅产量不能满足市场需求,而且品质也得不到保证。胡萝卜是植物组织培养中经典实验材料之一,也是近年来进行遗传操作的主要材料。以胡萝卜原生质体为受体,进行外源基因导入的研究,首先要建立一套稳定、高效的原生质培养系统。因此,用细胞融合等现代生物技术将中药黄芪的药用成分基因转入胡萝卜中,为提高种质资源生物量、优化品质具有重要意义。
1.建立了由黄芪叶片诱导愈伤组织的技术体系。愈伤组织的诱导效果受培养基、植物生长调节激素种类、浓度以及配比等因素的影响。将叶片接种在MS的诱导培养基上,获得愈伤组织;然后在添加2,4-D的MS增殖培养基上获得增殖培养。
2.以黄芪叶片和愈伤组织为材料,对黄芪原生质体的制备分离技术进行了研究。结果表明:采用黄芪叶片制备原生质体远远优于黄芪愈伤组织,能够获得高产量高活力的原生质体;采用2.0%纤维素酶+0.5%半纤维素酶+0.5%果胶酶的混合酶,低速(35~40rpm)恒温摇床上水解12小时就能达到较好的分离效果,获得高质量的黄芪原生质体,并且黄芪原生质体纯化时以800rpm离心6~8分钟效果较好。
3.利用PEG结合高Ca2+-高pH法诱导胡萝卜的悬浮细胞系原生质体与黄芪的叶肉原生质体融合,从PEG不同浓度、不同处理时间以及不同原生质体密度对原生质体融合的影响等方面优化了融合条件。6~8d观察到第一次细胞分裂,25~30d形成多细胞团,继续培养获得愈伤组织。
4.进行电融合时最适宜的电场参数为:交流电场强度40V/cm、直流脉冲场强700V/cm、脉冲宽度40ps,在此参数下的电场处理不影响原生质体的活力。