施氏獭蛤胚胎发育转录组学研究及关键基因发掘验证

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施氏獭蛤(Lutraria sieboldii),俗称象鼻螺,主要分布于广西、广东和海南等潮下带至20米水深的近海海域。近年来,随着其养殖规模的不断增长,施氏獭蛤人工苗种已不能满足国内底播养殖和出口越南的需要。为挖掘参与施氏獭蛤胚胎发生的关键因子,精准解析施氏獭蛤配子发生、胚胎发生的分子调控机理,本研究在施氏獭蛤人工育苗基础上,观察并收集施氏獭蛤胚胎发育各个时期样品,通过高通量测序建立施氏獭蛤胚胎发育过程中的转录本变化情况,通过信息学分析鉴定差异表达基因和信号通路;并对鉴定所得的差异表达基因Sox的序列特征、表达规律等进行了研究,主要研究结果如下:1.应用二代转录组测序技术,对施氏獭蛤受精卵、分裂期、囊胚期、担轮幼虫、D形幼虫等不同胚胎发育阶段样品,进行建库测序,共获得97.22G数据量。生物信息学分析显示,施氏獭蛤胚胎组内各样本间相关性(皮尔逊相关系数的平方)均高于0.92,差异表达基因分析显示D形幼虫时期与担轮幼虫时期、担轮幼虫时期与囊胚期、囊胚期与分裂期、分裂期与受精卵期差异表达基因数量分别为11094、6406、8724和4198个(差异倍数大于2,P值<0.05)。KEGG通路聚集显示,差异表达基因主要涉及Wnt信号通路、TGFβ信号通路、Notch信号通路、Sox家族和HSP家族等。2.通过RT-PCR技术克隆获得施氏獭蛤Sox2、Sox9、Sox11和Sox14基因,它们的编码区长度分别为1020 bp、1449 bp、1167 bp和816 bp;进化树分析显示它们与硬壳蛤亲缘关系最为接近。qRT-PCR结果表明施氏獭蛤Sox基因在8种组织中都有表达,但在雌雄个体中表达量有明显差异。其中Sox2和Sox14在雌性施氏獭蛤的表达量较高,而Sox9和Sox11则是在雄性施氏獭蛤中表达量较高。此外在施氏獭蛤的性腺发育过程中,Sox2在卵巢成熟期表达量远高于精巢,是精巢的648倍;而Sox9在精巢的排放期是卵巢的2倍。3.在施氏獭蛤胚胎发育进程中,q RT-PCR结果显示Sox2在桑椹期表达量最高,而Sox9,Sox11和Sox14都在担轮幼虫期表达量最高。其中Ls Sox2在桑椹期表达量最高,在D形幼虫时期表达量最低,且桑椹期的表达量是D形幼虫时期的20倍;LsSox9在担轮幼虫时期的表达量为受精卵时期的73倍;Ls Sox14在担轮幼虫时期表达量为二细胞时期的201倍。总之,本研究完成了施氏獭蛤胚胎转录组测序,克隆获得了施氏獭蛤Sox2、Sox9、Sox11和Sox14基因,分析了它们在不同组织、不同发育阶段性腺和胚胎中的表达变化情况,但其具体功能还有待于应用RNAi和过表达等技术进行更深一步地研究。
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