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目的探讨胃癌细胞、组织中miR-218-5p的表达,采用生物信息学方法分析miR-218-5p表达并预测其靶基因,研究miR-218-5p通过靶基因调控胃癌发生发展过程的分子机制,以期在临床上为胃癌患者的治疗提供新的靶向治疗方案。方法利用实时荧光定量PCR检测不同分化程度的胃癌细胞和正常胃粘膜上皮细胞、胃癌组织和癌旁组织中miR-218-5p的表达,并分析临床意义。在miRecords、TargetScan、miRwalk、miRDB及Pictar网站在线预测其靶基因,取交集后选择至少有三个软件支持的靶基因。运用DAVID6.7数据库,富集分析其靶基因参与的信号通路,并采用OncomiR数据库对miR-218-5p在胃癌中的表达进行分析。培养人胃癌细胞SGC-7901和HGC-27,待细胞状态良好加入慢病毒感染,使miR-218-5p在胃癌细胞中表达增加,将实验分为LV-NC组和LV-miR-218-5p组。使用倒置荧光显微镜观察暗视野下绿色荧光细胞,利用Image软件计算荧光细胞所占比例,粗略估计其感染程度,后利用RT-qPCR检测miR-218-5p的上调倍数。miR-218-5p过表达后,进行一系列细胞功能实验。MTT、细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况、细胞划痕愈合、Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力、流式细胞术检测细胞周期分布改变及凋亡情况、RT-qPCR和Western blot法检测周期及凋亡相关基因表达。运用生物信息学软件预测miR-218-5p的靶基因,选取三个以上软件支持的靶基因,利用RT-qPCR检测候选靶基因在miR-218-5p过表达后的表达情况,并结合查文献分析各个候选靶基因在胃癌中有无报道并最终筛选出HOXA10基因。构建HOXA10-3’UTR-WT和HOXA10-3’UTR-mut质粒,通过双萤光素酶报告基因实验验证miR-218-5p是否与HOXA10的3’UTR区域特异性结合。采用慢病毒shRNA在胃癌细胞中沉默HOXA10,将实验分为shRNA-NC组和shRNAHOXA10组。倒置荧光显微镜和RT-qPCR分别观察其感染程度和检测HOXA10的下调倍数。胃癌细胞被慢病毒成功感染后,进行细胞功能实验,实验方法与前期miR-218-5p一致,观察HOXA10沉默对胃癌细胞增殖、侵袭迁移、周期及凋亡等生物表型的影响。结果1.与GES-1细胞相比,miR-218-5p在不同分化程度的胃癌细胞中表达明显减少。相对于癌旁组织,miR-218-5p在胃癌组织中也明显呈下调趋势,miR-218-5p的低表达与胃癌淋巴结转移(P=0.000)及TNM分期(P=0.000)具有相关性。生信分析显示:miR-218-5p在胃癌中低表达,且其靶基因富集在与肿瘤相关的多个信号通路。2.在胃癌细胞中过表达miR-218-5p后,采用倒置荧光显微镜观察,Image软件测量约有80%细胞带有绿色荧光。感染细胞经RT-qPCR检测发现,LV-miR-218-5p组中miR-218-5p的表达水平明显高于LV-NC组(P<0.01);MTT实验和细胞克隆形成实验显示过表达miR-218-5p后胃癌细胞增殖能力显著减弱(P<0.01);细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验显示miR-218-5p可明显抑制胃癌细胞的迁移及侵袭能力(P<0.01);流式细胞术结果显示miR-218-5p可以改变胃癌细胞周期分布,将其阻滞于S期,并诱导其凋亡。RT-qPCR和Western blot实验结果显示,miR-218-5p过表达后,可以上调p21、p27、p53、Bax、C-Caspase3、C-Caspase9表达量,而使基因CDK6、Bcl-2下调。3.运用生物信息学方法预测靶基因,选取HOXA10、COL1A1、LASP1、TPD52、CLDN2、CDH2、HMGB1、LMNB、SLC6A1、MBNL1作为miR-218-5p候选靶基因,RT-qPCR结果显示miR-218-5p过表达后这10个靶基因的表达量均显著降低(P<0.01)。选取HOXA10作为miR-218-5p的可能靶基因,RT-qPCR和Western blot结果均表明,相对于GES-1细胞,HOXA10在胃癌细胞中呈高表达状态(P<0.01),且miR-218-5p过表达后HOXA10表达降低,miR-218-5p负向调节HOXA10的表达(P<0.01)。双萤光素酶报告基因实验结果显示,miR-218-5p可与HOXA10的3’UTR区域特异性结合以调控基因的表达。沉默HOXA10后,在荧光显微镜下观察绿色荧光,利用Image软件测量荧光细胞数量约占全视野的80%以上,RT-qPCR结果显示shRNA-HOXA10组中HOXA10的表达水平明显低于shRNA-NC组(P<0.01),证明感染成功;MTT实验和细胞克隆形成实验显示沉默HOXA10后明显降低了胃癌细胞活力,增殖能力也随之减弱(P<0.01);细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验显示沉默HOXA10可以减弱胃癌细胞的迁移和侵袭能力;流式细胞术结果显示沉默HOXA10可以将胃癌细胞阻滞在S期,并诱导其凋亡。RT-qPCR和Western blot实验结果显示,沉默HOXA10后,p21、p27、p53、Bax、C-Caspase3、C-Caspase-9的表达量升高,而CDK6、Bcl-2的表达量下降。结论1.miR-218-5p在胃癌中表达下调,起到潜在的抑癌作用,成为潜在的治疗靶点和预后标志物。2.miR-218-5p可以抑制胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力,将胃癌细胞阻滞在S期并诱导其凋亡。3.HOXA10是miR-218-5p的靶基因,沉默HOXA10后,可以抑制胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力,将胃癌细胞阻滞在S期并诱导其凋亡,与miR-218-5p结果一致。miR-218-5p可以通过负向调节HOXA10的表达抑制胃癌的发生发展。