脓毒症(sepsis)是感染引起的全身炎症反应征候群,其严重并发症——感染性休克(septic shock)是创伤、烧伤和手术后病人最主要的死亡原因之一。统计表明,临床半数的脓毒症是由于革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)感染引起的,革兰氏阴性菌的细胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),或称为内毒素(endotoxin),被认为是革兰氏阴性菌引起脓毒症的主要作用分子。LPS广泛作用于机体多种组织器官,其中内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞是最主要的效应细胞,在LPS的刺激下,它们产生大量的细胞因子,即“细胞因子风暴”(cytokine storm),进而引起失控性的炎症级联反应,最终引起内毒素休克、组织损伤和多器官功能障碍(mutiple organ dysfunction)。因此,脓毒症(sepsis)或内毒素休克(endotoxic shock)的分子机制的研究大多集中在内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞上,而在其它组织和器官上的相对研究较少。其实,脓毒症是多组织器官和系统的疾病,疾病从菌血症(bacteremia)、毒血症(toxicemia)演进到休克、多器官功能障碍的过程中,不但病原微生物及其毒性产物会与机体组织器官发生相互作用,而且各组织器官之间也会发生错综复杂联系,共同促进疾病的发生发展和转归。肝脏是人体代谢的枢纽,是重要的免疫器官,血液中大量蛋白也是由肝脏合成分泌的。在脓毒症的炎性应激刺激下,肝脏大量合成分泌急性期蛋白(acute phase protein,AP),发挥一种启动迅速的机体防御机制,然而肝脏对病原微生物或其毒性产物产生什么样的反应,与及脓毒症或感染性休克发生发展进程中肝脏自身变化如何?肝脏通过什么样的分子调控机制调节多种炎症相关反应蛋白的表达?对于这些问题,目前所知有限。这些问题的解答,对于了解错综复杂的脓毒症及其感染性休克的发病机制是很重要的。而本研究关注在内毒素休克早期肝脏细胞核发生相应变化的分子机制。细胞核是遗传物质的主要存在部位,基因信息在这里存储管理,并根据细胞的生命活动而被转录出来,从而使细胞适应内环境和本身生命周期的改变,是细胞生命活动的控制中心。核内的蛋白质组主要由核骨架蛋白、核膜蛋白、核仁蛋白、参与调节转录过程的蛋白、参与染色体形成的组蛋白和非组蛋白组成,共同参与细胞核内的功能事件,执行细胞核的功能。在生命活动过程或疾病过程中,这些蛋白质的组成及翻译后修饰状态都会发生相应的变化,如当细胞受到某种刺激后,信号从胞外传递到胞内,细胞内已有蛋白质修饰或结构状态会发生相应的变化,从而使这些蛋白质激活或失活,从而做出即刻的反应,也有一部分蛋白质穿梭出入细胞核,共同参与某些基因的表达,以对外界刺激做出长效的反应。在蛋白质的翻译后修饰中,磷酸化(phosphorylation)修饰是目前认识得最多、最为重要的机制之一,对众多蛋白质生物化学功能担负开/关调控作用,是许多生命现象的关键调节机制,几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。因此,通过了解内毒素休克发生发展过程中核内磷酸化蛋白质组的变化,可以帮助我们了解内毒素休克时肝脏做出的反应的机制。以往的研究大多是在已有的工作基础上对少数几个细胞分子进行分析、在理论上推导出对疾病发生发展可能具有重要意义的分子,进而进行深入细致的功能研究。这是一种传统的研究策略,其优点是研究问题集中,容易深入,可以比较透彻地回答一个点上的问题,但是若将这个结果放到一个体系层面上,其功能又变得扑簌迷离,这是由“分析”主导的研究手段的局限所导致的,只有当这种“点”的结果积累得足够多的时候,体系的问题也会变得逐渐清晰起来,但这个过程一般需要长时间的积累。随着人类基因组计划(human genomic project,HGP)的完成、蛋白质组学的理论系统和技术方法已成为后基因组时代的主旋律。这为我们从另一个角度,采用“综合”的研究手段,用系统的观点来研究问题提供了机遇。本课题在体系的角度上提出问题,拟应用蛋白质组学的方法进行研究。由于蛋白质组学研究具有大规模、高通量、高灵敏度的特点,因此可以有效分析细胞内的整体蛋白质。然而整个细胞或组织的蛋白组成极其复杂,直接对其进行蛋白质组学分析,往往会丢掉很多蛋白质信息,由此衍生出了亚细胞蛋白质组学。亚细胞蛋白质组就是利用蛋白质组学研究技术来分析一种组织或细胞的某一个亚细胞结构内的蛋白质组成,它一方面可以降低样品的复杂度,使分析简单化;另一方面可以相对富集相应亚细胞结构的低丰度蛋白,并且可以部分提示蛋白质的定位和功能信息。而最近发展起来的蛋白组学新方法,如:荧光差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis,DIGE)技术由于继承了二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)的高分辨率,同时又具备高重现性、高灵敏度、高通量和高动态范围等优势,更为我们提供了一个方便有力的研究手段。基于上述分析,本研究选用了BALB/c小鼠的肝脏作为研究对象,利用LPS作为刺激因子,制备内毒素休克动物模型,从而获取这种疾病状态下的肝脏组织。取LPS刺激1小时(hour,h)组和正常对照组小鼠,麻醉后取其肝脏,利用差速离心和密度梯度离心方法来提取纯化肝脏细胞核,并裂解得到细胞核的全蛋白,随即利用磷酸化富集柱富集核磷酸化蛋白。用DIGE技术建立了内毒素休克早期小鼠肝脏细胞核差异磷酸化蛋白质组表达谱,通过DeCyder 2D差异分析软件分析后找到差异蛋白点31个,表达上调的有21个点,下调的有10个点。对这些差异蛋白点利用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定,共鉴定出29种蛋白质。本研究,我们得到了以下几点结论:1.成功提取并纯化得到了小鼠肝脏细胞核,并用分别用荧光显微镜、透射电镜及质谱技术进行了验证。2.建立了正常组与内毒素休克早期BALB/c小鼠肝脏细胞核磷酸化蛋白质组的差异双向图谱。3.运用Decyder差异分析软件得到了31个差异胶点,并进行了质谱鉴定,最后鉴定出了29种蛋白质。4.对这29个蛋白质进行亚细胞定位分析,结果完全定位于细胞核内的有1个;既可定位于细胞核内,又可定位于胞浆的有21个;既可定位于细胞核内,又可定位于其它亚细胞结构的有1个(胞浆除外);在其它亚细胞结构定位,但是没有定位于细胞核内的有6个。5.通过生物信息学分析发现这些差异蛋白涉及到RNA加工剪接,基因表达调控,细胞增殖分化,蛋白转运,转录调控和细胞信号转导。通过该研究我们在本实验室建立了磷酸化蛋白质纯化技术联合DIGE电泳技术的研究平台,并利用该技术来研究小鼠肝脏细胞核的磷酸化蛋白组表达差异。这不仅为揭示内毒素休克早期细胞核发生相应变化的分子机制提供了新的技术方法,而且也为深入研究脓毒症的发病机制及其防治策略提供了新的机遇。