研究背景原癌基因存在于正常细胞内,参与细胞的信号转导、基因表达与调控,进而控制细胞的生长、增殖与分化,是维持机体正常生命活动所必需的。癌基因是指在自然或实验条件下具有诱导恶性转化的潜在活性基因,大多数癌基因是从急性转化性逆转录病毒中分离得到的,这些癌基因来源于真核细胞,当涉及到癌基因的相应细胞对应物时,也称作原癌基因或细胞癌基因。Ras基因是癌基因的一种,其基因家族包括K-ras、H-ras和N-ras,在正常细胞中原癌基因Ras能促进细胞增殖和生长,当其发生突变激活时,能持续促进细胞增殖,进而使细胞发生恶性转化。但是研究发现单独激活癌基因Ras不会使细胞发生恶性转化,它需要在某些抑癌基因失活或其它的条件共同作用下才能使细胞发生恶性转化。研究指出在胰腺癌上皮细胞中经常会发现K-ras的激活和p16抑癌基因的失活,在人胰腺上皮细胞中激活K-ras抑制p16可以使细胞绕过衰老,细胞生长迅速,在小鼠实验中也发现缺失p16基因的小鼠致瘤率明显增加,但是单独的癌基因Ras只是诱导细胞发生衰老而不能使纤维细胞发生恶性转化。癌基因Ras诱导的衰老如果在某些抑癌基因如p16缺失的条件下,可以使细胞绕过衰老,促进细胞恶性转化。癌基因的这种诱导细胞衰老来抑制细胞的恶性转化的现象,可能是由于细胞本身存在维稳机制且肿瘤的形成是一个累积的漫长的过程。研究发现除了细胞的衰老以外,癌基因Ras在诱导衰老的同时会改变细胞的自噬活性,且自噬在肿瘤的形成中起到重要作用。自噬是细胞内的物质成分被溶酶体降解的过程,广泛存在于真核细胞中,在正常生长条件下生物体可通过基础自噬来维持蛋白质、细胞器等的更新,为生命活动提供能量,对维持细胞内环境稳定起到重要作用。肿瘤细胞中的自噬是一把双刃剑,一方面,自噬通过降解具有促进肿瘤形成作用的特殊蛋白或降解受损细胞器来减轻这些因素对细胞的不良刺激,最终防止基因组损伤来抑制癌症发生。另一方面,在肿瘤生长的后期,自噬降解细胞内蛋白质和细胞器为肿瘤细胞提供营养及能量,以利于肿瘤细胞在营养缺乏和低氧环境中生长。所以在肿瘤进展的不同阶段,自噬所扮演的角色也有很大不同。研究目的和意义由于细胞存在维持基因组稳定的机制,单独的癌基因Ras的激活并不能诱导细胞发生恶性转化,仅能使细胞发生衰老,这也是机体的一种自我保护机制,使机体发生恶性转化的几率降低。目前发现在癌基因Ras过度表达或激活后,自噬活性在癌细胞和非癌细胞均上调,并产生抑癌作用。然而,癌症前体细胞是如何克服这些保护机制发生癌变,尚不明确。本实验目的是研究在人类成纤维细胞过度表达H-Ras后细胞自噬活性,并且研究自噬抑制程度不同对细胞的影响。以期探讨自噬调控在癌症形成机制中的可能作用。实验方法1.细胞衰老的p半乳糖苷酶(β-Gal)染色将六孔板中的细胞,吸去细胞培养液,用PBS洗涤1次,加入1mL μ-GaL染色固定液(0.5%戊二醛在PBS中),室温固定15 min。吸除细胞固定液,用含2mM MgCL2的PBS洗涤细胞3次,吸去PBS,每孔加入1 mLβ-半乳糖苷酶染色工作液。37℃孵育2-4 h,最多12-16 h。在普通光学显微镜下观察,计数,并计算被染上蓝色的细胞数目的百分比。2.生长曲线检测细胞生长趋势取经逆转录病毒感染并用适当的药物筛选4天后的对照组WH细胞、过度表达Ras组细胞、分别经10 nM雷帕霉素或者10μM氯喹处理的对照组WH细胞和过度表达Ras组的细胞。将感染后的第6天定义为细胞生长曲线的第0天。将细胞按104个/孔种在12孔细胞培养板上,平行种3孔,每4天计数一次后,细胞仍以104个/孔种回到新的细胞培养板中,总共连续计数3次,共计数12天。以培养时间为横轴,细胞倍增数(Population doublings, PD)为纵轴,绘制生长曲线。细胞倍增值PD的计算公式：PD=log(N2/N1)/log2。N1是种植的细胞数,N2是长到第4天的细胞数。3. Western blot检测蛋白表达的变化将细胞裂解于裂解液中,在冰上超声30 s后,4℃、12000 g高速离心15min,收集细胞上清,用Bradford法分析定量。上样于凝胶上,再转到尼龙纤维膜上,5%脱脂奶粉封闭过夜,加入一抗(p62,LC3, p16INK4A, Phospho-p53(Ser15), Ha-Ras (C-20), ATG 7、β-actin)于4℃孵育过夜。在室温加入相应的辣根过氧化物酶耦联的二抗孵育1h。洗膜后加入显色液,采用Kodak胶片曝光。4. siRNA介导自噬相关基因表达降低后衰老和蛋白的变化使用HiPerFect转染试剂,将Atg7、Atg5 siRNA分别转染进细胞,培养48h后收集细胞,Western blot检测细胞Ras、p16、LC3、p62等蛋白表达。5.流式细胞仪检测细胞凋亡率取对照组细胞WH、过度表达Ras组细胞、经10nM的雷帕霉素或者10μM的氯喹处理的对照组细胞WH和过度表达Ras组细胞。收集细胞PBS洗一次,弃去上清,使用1×Binding buffer 100μl重悬细胞,加入5μl AnnexinV和5μlPI试剂温和混匀,室温避光孵育15 min后再加入300μl 1×Bing buffer,1h内避光进行流式细胞检测。6. Hochest和PI染色收集细胞,加入终浓度为1μg/ml的Hoechst33342和终浓度为1μg/ml的PI染料,室温避光孵育10-15 min,荧光显微镜下使用紫色和蓝色激发光观察,计数500个细胞,细胞死亡率以PI阳性细胞占总细胞百分率表示。实验结果1.癌基因Ras过度表达诱导人成纤维细胞衰老从β-半乳糖苷酶染色结果中可以发现,过度表达Ras组细胞的蓝染数目明显多于对照组WH细胞,说明过度表达Ras后,细胞出现衰老。细胞的生长曲线结果显示,对照组WH细胞呈指数倍增,而过度表达Ras组细胞生长停滞,并逐渐出现细胞负增长。使用Western blot进一步检测细胞的蛋白表达水平,结果显示过度表达Ras组细胞的p16、pp53蛋白明显高于对照组WH细胞。2.癌基因Ras过度表达抑制人成纤维细胞自噬Western blot结果显示,阳性组Ras细胞的LC3、p62蛋白均明显高于对照组WH细胞,说明过度表达Ras蛋白后细胞自噬被抑制,且细胞在自噬后期被抑制。加入自噬诱导剂雷帕霉素后,LC3和p62蛋白水平均明显降低,表明过度表达Ras后细胞的自噬确实被抑制。3. 自噬抑制剂氯喹能增加细胞衰老使用自噬抑制剂氯喹作用细胞后,行p-半乳糖苷酶染色。Ras组细胞加氯喹后细胞蓝染数目明显多于未经处理的Ras组细胞。生长曲线结果也显示Ras组细胞加氯喹后,细胞的生长曲线负增长趋势更加明显,且Western blot结果显示随氯喹作用时间增加,细胞p16、pp53表达明显增加。而对照组WH细胞p16和pp53表达少量增加,但细胞p-半乳糖苷酶染色和生长曲线变化不明显。4. 自噬诱导剂雷帕霉素减轻细胞的衰老程度使用雷帕霉素作用细胞后,p-半乳糖苷酶染色结果显示,过度表达Ras组细胞加雷帕霉素后,细胞的蓝染数目显著降低,而对照组WH细胞加雷帕霉素后细胞蓝染数目无变化。生长曲线结果显示过度表达Ras组细胞加雷帕霉素后,细胞的负增长趋势稍有缓和。且Western blot结果,随雷帕霉素作用时间增加,蛋白p16、pp53水平均降低。5.抑制ATG7、ATG5的表达使过度表达癌基因Ras的人成纤维细胞衰老程度增加使用RNA干扰,抑制ATG7、ATG5的表达,可阻断自噬体的形成,抑制自噬的早期阶段,可以发现使用RNA干扰后,细胞的ATG7、ATG5的表达明显下降,过度表达Ras组细胞p62出现明显累积,p16、pp53蛋白明显升高,而在对照组WH细胞中这些变化均不明显。6.氯喹和雷帕霉素处理改变Ras过度表达细胞的凋亡率细胞周期结果显示,氯喹处理细胞后,过度表达Ras组细胞subG1期比例迅速升高,并且明显高于未经处理的过度表达Ras组细胞,雷帕霉素处理细胞后,过度表达Ras组细胞subGl期也显著升高,但很快降低,在第3天后与未经处理的过度表达Ras组细胞无差异。Hochest和PI染色结果显示,氯喹处理的过度表达Ras组细胞PI阳性细胞明显增加,雷帕霉素处理的过度表达Ras组细胞PI阳性细胞明显减少,以上结果在对照组细胞的变化均不明显。结论1.癌基因H-Ras过度表达能诱导人成纤维细胞衰老；2.癌基因H-Ras过度表达抑制人成纤维细胞自噬；3.氯喹或降低自噬关键基因表达来抑制自噬,可加重过度表达癌基因H-Ras的人成纤维细胞的衰老；4.使用雷帕霉素诱导细胞自噬,能减轻过度表达癌基因H-Ras的人成纤维细胞的衰老。以上结果提示出H-Ras对自噬抑制的精确调控可能是Ras过度表达后通过瓶颈效应诱导肿瘤形成的机制。