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第一部分TRAF3和VPS33B血小板特异性基因敲除小鼠的繁殖和鉴定目的：制备肿瘤坏死因子受体相关因子3(TNF receptor associated factor 3, TRAF3)和空泡分选蛋白33同系物B (vacuolar protein sorting 33 homolog B, VPS33B)血小板特异性基因敲除小鼠,用于研究TRAF3和VPS33B在血小板功能中的作用。方法：通过实验室已有的VPS33Bfl/fl基因打靶小鼠,TRAF3fl/fl基因打靶小鼠和Pf4 Cre小鼠,繁殖建立血小板的VPS33B和TRAF3特异性基因敲除小鼠和它的背景对照杂合子小鼠。并用PCR和western blotting方法检测基因敲除小鼠的基因型和蛋白表达。结果：通过数代的繁殖,建立起稳定可靠的TRAF3和VPS33B基因敲除模型,并在后续的实验中,采取小鼠尾部PCR基因鉴定的方法,来检测基因敲除小鼠和其杂合子基因对照,用于后续的实验。结论：LoxP/Cre条件性基因敲除的方法,能克服基因敲除TRAF3和VPS33B引起的高的致死率,成功建立了研究TRAF3和VPS33B的条件性基因敲除小鼠模型。第二部分TRAF3基因敲除对血小板聚集和血栓形成的影响及其机制目的：CD40配体(CD40L)是肿瘤坏死因子TNF家族的成员分子。CD40L结合到CD40上,增强血小板激活和血栓形成。肿瘤坏死因子受体相关因子(TNFreceptor associated factor,TRAF)家族在CD40L-CD40相关信号转导中扮演重要角色。目前,尚无报道研究TRAF家族成员TRAF3在血小板中的表达和功能。因此,本研究通过TRAF3特异性基因敲除小鼠研究TRAF3在血小板聚集和血栓形成中的作用及其机制。方法：采用血小板聚集仪观察TRAF3-/-和wildtype小鼠对不同激动剂(collagen,thrombin,Par4)诱导的血小板聚集的影响,并检测外源性添加CD40L对TRAF3-/-和wildtype小鼠血小板聚集的影响。采用流式细胞术和western blotting检测TRAF3-/-和wildtype小鼠血小板上GPVI和整合素β3表达的变化,以及TRAF3-/-和wildtype小鼠止血和血栓形成时间的变化。结果：本研究发现,在人和小鼠的血小板细胞中都可检测到TRAF3的表达。作为血小板聚集和激活的负性调控因子,TRAF3敲除显著增加凝血酶和胶原诱导的血小板聚集和释放。血小板表面胶原受体GPVI.整合素αIIbβ3和TRAF2的表达都没有被敲除TRAF3影响,说明在TRAF3敲除小鼠中增高的血小板激活并不是因为血小板受体表达的增高,也不是由于TRAF3基因敲除引起其它TRAF家族蛋白比如TRAF2蛋白表达的变化。在TRAF3敲除小鼠中,氯化铁诱导的动脉血栓模型中的血栓形成时间显著降低,但在小鼠断尾流血时间实验中,止血时间未发现受TRAF3基因敲除的影响。结论：TRAF3在血小板激活和血栓形成中具有负性调节作用。这一作用和TRAF家族其它的血小板功能蛋白不同,不依赖CD40L和CD40等血小板表面的受体实现。第三部分VPS33B基因敲除对血小板聚集和血栓形成的影响及其机制目的：整合素是一种异质二聚体膜蛋白,包含α和β亚基,在细胞粘附和转移等各种生理功能中起着基础性的重要作用,血小板整合素aIlbβ3在血小板功能和生理止血中可能有着重要的意义。调节血小板中整合素激活的分子机制目前尚不清楚。VPS33B是一种新的整合素结合蛋白。目前,尚无报道研究VPS33B在血小板中的表达和功能。因此,本研究通过VPS33B特异性基因敲除小鼠研究VPS33B在血小板聚集和血栓形成中的作用及其机制。方法：采用血小板聚集仪观察VPS33B敲除小鼠对不同激动剂(collagen, thrombin)诱导的血小板聚集和释放的影响,采用流式细胞术检测VPS33B敲除小鼠和野生对照型小鼠血小板血小板整合素aIlbβ3等指标的含量以及结合率。采用荧光显微镜观察VPS33B敲除和过量表达VPS33B对血小板在固化纤维蛋白原上的扩展等功能影响。观察VPS33B敲除对斑块回缩的影响。采用蛋白印迹法检测VPS33B对血小板的主要信号通路蛋白及血小板“由外向内”信号转导的影响。结果：我们发现VPS33B作为Secl/Munc18 (SM)蛋白家族的一员,能直接和整合素β亚基结合。在CHO细胞株中过量表达VPS33B能增强aIIbβ3 outside-in信号通路而不影响inside-out信号通路。我们构建了血小板特异性VPS33B敲除小鼠,从这些小鼠血液中分离的血小板具备正常的生理形态,然而它们在纤维蛋白原上的扩展功能发生了改变,斑块回缩功能也受到了影响。在VPS33B敲除小鼠中,在低浓度激动剂的刺激下,血小板的聚集和ATP的释放功能都减弱。在VPS33B敲除小鼠中小鼠断尾流血时间和血栓形成时间对比野生型小鼠都延长了。结论：我们的研究表明VPS33B是一种新的血小板整合素结合蛋白,它和β亚基结合。VPS33B通过影响整合素信号“外面向内”信号通路对血小板聚集和血栓形成产生了影响。