[目的]1.构建重组腺病毒搭载的基因]mda-7(melanoma differentiation-associated gene-7,黑色素瘤分化相关基因-7)／IL-24(Interleukin-24,白介素24)。2.使用构建好的载体系统Ad-mda-7/IL-24感染人喉癌Hep-2细胞系后通过定性、定量方法观察对喉癌细胞生长的影响。[方法]1.鉴定pPEP4质粒上的mda-7/IL-24, KpnI和XhoI限制性核酸内切酶消化腺病毒穿梭质粒载体pAdtrackCMV(含绿色荧光蛋白GFP),连接后转化感受态E.coli DH5a,卡那霉素筛选克隆,抽提质粒,酶切、PCR鉴定；PmeI单酶切线性化搭载mda-7/IL-24基因的穿梭质粒pAdTrackCMV-mda7,与腺病毒骨架质粒AdEasy-1一起电转化至重组专用感受态细胞BJ5183,两质粒同源重组,卡那霉素+链霉素双抗筛选克隆,质粒抽提、电泳,PacI单酶切鉴定重组克隆,将阳性克隆质粒再转化入E.coli DH5a感受态,卡那霉素筛选克隆,再次抽提质粒,电泳、酶切、PCR鉴定获得pAd-mda7和pAd-GFP;限制性核酸内切酶PacI单切pAd-mda7和pAd-GFP,切胶回收、质粒定量后转染人胚肾293T细胞行病毒扩增,收集病毒并行滴度测定备用。2.Hoechst33258染色---定性检测：将喉癌Hep-2细胞接种于6孔板,一孔计数,三孔分别加入等量一定感染复数(MOI)的Ad-mda-7(Ad组),Ad-GFP(Ead组)以及PBS缓冲溶液(Control组)。感染48h后,将细胞固定Hoechst33258染色,反复洗涤后倒置荧光显微镜下观察细胞数量、细胞形态以及细胞颜色分布和亮度。3.PI染色后流式细胞仪分析--定量检测：选择合适感染复数(MOI)感染6孔板定量接种的Hep-2细胞,48h后收集细胞后离心、PBS缓冲液稀释,加入万分之三的TritonX-100细胞膜打孔,加入工作浓度PI(碘化丙啶)避光染色后,流式细胞仪计数检测,测定细胞周期变化。[结果]1.利用复制缺陷型腺病毒载体成功构建Ad-mda-7/IL-24以及Ad-GFP。2.光学显微镜下观察：24h后Ad-mda7组和Ad-GFP组Hep-2细胞开始部分脱离,且Ad-mda7组较Ad-GFP组脱离更多,细胞总数更少。PBS处理组正常生长,只有少量细胞脱离；48h后Ad-mda7组生长状态明显影响,状态差,贴壁细胞明显减少,而Ad-GFP组细胞生长状态受到一些影响,一部分细胞也脱离培养孔生长,相比前者,细胞数量更多(包括仍贴壁细胞和细胞总数量),生长状态更好。PBS组细胞已经基本长满培养孔,有少量细胞自然脱离生长。72h后细胞生长状态明显变差,Ad-GFP组与Ad-mda7组均大量脱离,PBS处理组也有很多细胞脱离。3.荧光显微镜下观察Hoechst 33258凋亡染色结果：Ad-mda7处理组细胞固缩,细胞核致密浓染,颜色发白；Ad-GFP处理组细胞也有一些收缩和20%左右的细胞脱离,但无凋亡染色特征；PBS处理组细胞形态饱满,生长正常。4.PI染色流式细胞仪检测结果：以MOI=30感染48h后Control组SubG1期比例5.84%;Ead组SubG1期比例为14.53%;Ad-mda7处理,SubG1期比例为21.65%,凋亡细胞所占比例递增；MOI=50, G2M Block检测结果：Ad-mda7组G2/M Block期比例为40.60%,Ad-GFP组G2/M Block期比例为7.93%,PBS组相应G2/M Block期比例为2.24%。[结论]1.重组人5腺病毒系统(由穿梭质粒pAdTrackCMV,腺病毒骨架质粒AdEasy 1,以及重组优化大肠杆菌BJ5183组成)中,穿梭质粒pAdTrackCMV上构建有绿色荧光蛋白(GFP)以及多克隆区域,可以用来搭载mda-7/IL-24。骨架质粒AdEasy 1缺失了腺病毒基因组的E1区和E3区,使得所生产的腺病毒不能在911和293以外的细胞中自我扩增,保证了实验的剂量可控性和以及生物安全性,但是又保留了病毒高效的感染能力以及搭载基因的蛋白表达能力。2.Ad-mda-7/IL-24转染喉癌hep-2细胞后48h检测各项指标较理想,72h细胞生长状态明显变差,各实验组细胞大量脱离,不适合用于进一步细胞处理和检测。3.腺病毒搭载的mda-7/IL-24对喉癌hep-2细胞生长有抑制和促凋亡作用,且对喉癌细胞生长的阻滞作用可能与感染复数正相关。