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背景及目的关节软骨缺损修复困难,历来是医学界的难点及研究热点。目前,组织工程技术已经成为其主要的研究方向,并且取得了一定的进展,组织工程技术包括种子细胞、支架材料、生长因子三部分。另外,中医药在该领域中,已经被证实具有良好的临床疗效。我们筛选单味中药—威灵仙作为研究对象,有研究证明威灵仙能够维持和促进软骨细胞合成蛋白多糖与Ⅱ型胶原,并可能通过抑制白细胞介素1水平的增高保护关节软骨。本课题将威灵仙与组织工程技术结合,观察威灵仙促进软骨细胞增殖、干预C/β-GP凝胶复合同种异体软骨细胞体外三维培养以及修复软骨缺损的作用,探讨中医药与现代医学结合的方式与价值。方法1.体外分离培养兔膝关节软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定后,取处于对数生长期第3代细胞随机分组进行培养,倒置显微镜观察软骨细胞形态变化,MTT法检测不同浓度威灵仙对软骨细胞增殖的影响,RT-PCR法检测TGF-β1mRNA表达。2.按7：1比例制备C/β-GP复合软骨细胞凝胶,随机分为实验组和对照组,分别给予相应处理,MTT法检测不同浓度威灵仙对凝胶中软骨细胞增殖的影响,HE、TB和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察1、4周凝胶中软骨细胞的组织学变化。3.复制关节软骨缺损模型,24只新西兰白兔随机分为3组,即实验组(C/β-GP+软骨细胞+威灵仙培养基关节腔注射组)、对照组(C/β-GP+软骨细胞+普通培养基关节腔注射组)、模型组(模型组),分别给予相应处理,术后6、12周后分别行大体观察及HE、TB、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,并进行Wakitani评分。结果1.不同浓度威灵仙均能促进软骨细胞增殖,尤以0.5mg/ml增殖效果明显,且增殖高峰出现在威灵仙干预后的第3天。0.05、0.1、0.5、1.0mg/ml威灵仙均能促进软骨细胞TGF-β1 mRNA表达,4组组间差异无显著性意义,但作用的高峰为0.5mg/ml组。2.软骨细胞能良好地在C/β-GP凝胶内伸展、粘附、生长和增殖。各浓度组威灵仙均能促进软骨细胞在凝胶中的增殖,其中0.5mg/ml威灵仙的效果最明显,且能促进软骨细胞Ⅱ型胶原、细胞外基质的分泌。3.实验组、对照组可见缺损关节面被较好地填充,并形成透明软骨样结构,实验组表面平整度及与周围组织整合程度较对照组好,组织学切片上可见类软骨形成并分泌软骨基质和特异性Ⅱ型胶原,模型组未见修复,可见组织增生退变。实验组修复组织与周围组织整合程度、组织学及Ⅱ型胶原分泌量均好于对照组。Wakitani评分：实验、对照两组分值显著低于模型组分值(P<0.01),且实验组分值明显低于对照组分值(P<0.05)。结论1.威灵仙能促进软骨细胞增殖及TGF-β1 mRNA的表达,这种类细胞生长因子作用可能是其促进软骨修复的机制之一；2.C／β-GP凝胶与软骨细胞具有良好的相容性,威灵仙能够促进软骨细胞在C／β-GP凝胶中的增殖、Ⅱ型胶原、蛋白多糖的分泌及成软骨化发展。3.威灵仙能够促进可注射性C／β-GP凝胶复合同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损,这为中医药与组织工程技术的结合提供了新思路、新方法。