研究意义烧伤、战创伤可导致严重的组织缺损或肢体缺失，由于自体组织不足，患者常经受着不同程度的躯体障碍及心理负担。异体复合组织移植因可以提供良好的外形、功能修复，在国内外受到越来越多的认可。然而，移植术后长期免疫抑制剂的应用所引起的机会性感染和恶性肿瘤的风险，以及不可避免的慢性排斥反应严重阻碍了这一技术的临床应用。因此，探索新的抗移植物排斥方案，诱导免疫耐受，是亟待解决的重大临床问题之一。近年来通过血管化骨髓移植建立嵌合体从而诱导免疫耐受，已经在肝、肾、心脏等实质器官移植和血管化的复合组织移植中得到证实，并有望解决包括肢体移植在内的异体器官移植排斥反应。VBMT是在进行器官或复合组织移植时，同时进行血管化的含骨髓的骨质移植。在一定免疫抑制方案的维持下，移植物携带的骨质成分可以提供持续稳定的供体骨髓细胞及骨髓基质细胞，从而向受体提供持续的供体抗原刺激，逐渐促进免疫耐受的产生，并有望在停止免疫抑制剂应用后达到移植物的长期存活。这一理论提示：异体肢体复合组织移植物内所携带的血管化骨质的存在可能有助于增加嵌合体的水平，并延长移植肢体的存活时间。骨髓间充质干细胞是一群具有自我更新能力的成体非造血多能干细胞，具有丰富的生物学功能。因低表达MHC Ⅰ类分子，不表达MHC Ⅱ类分子和CD40/CD80/CD86等T细胞活化的协同激活分子而具有低免疫原性，从而可以在不同品系、种属间进行移植而免于被排斥。低免疫原性以及免疫调节作用两方面特性使得其在治疗移植排斥方面具有潜在优势。基于目前肢体移植作为血管化骨髓移植诱导免疫耐受的可能性以及BMSCs对肢体存活影响的机制空白，本研究拟首先检测肢体内骨质成分对自身存活的影响及其机制，并进一步研究BMSCs对移植肢体排斥反应的影响及其机制，论证BMSCs用于异体肢体移植、建立嵌合体并诱导免疫耐受的可行性。材料与方法1.建立大鼠异体肢体去骨复合组织移植模型，以完整的异体肢体模型为对照，研究去骨组织瓣模型制备操作过程对肢体血流及存活的影响，在降阶梯环孢霉素A（CsA）的维持下，观察两组移植物存活情况，分析肢体内骨质成分对移植肢体自身成活的影响；2.在大鼠异体肢体模型的基础上，设立同基因肢体移植组（组1、2）、同种异基因肢体移植排斥组（组3、4）及同种异基因肢体移植CsA治疗组（组5、6），组1、3、5分别进行完整肢体移植，组2、4、6分别进行去骨的肢体移植，每组8只受体。检测肢体移植后受体嵌合体水平以及免疫耐受形成过程中Treg的变化，研究影响异体移植物存活的分子机制；3.探讨不同预处理因素对BMSCs免疫调节作用的效应，并观察其体内应用后对移植肢体存活影响；4.研究IFN-γ预处理的BMSCs发挥免疫调节作用的具体机制，进一步通过混合淋巴细胞反应观察预处理IFN-γ预处理BMSCs对T细胞活化、凋亡以及向Treg分化的影响。结果1.成功建立了大鼠完整肢体移植模型以及去除骨质的肢体移植模型，证实了去骨肢体移植模型可作为完整肢体模型的对照物，研究肢体内骨质成分对自身成活的影响。研究发现，在降阶梯的CsA免疫抑制方案下，完整的异体肢体均可长时间存活，然而，去除骨质后移植物的存活时间明显缩短，揭示了骨质成分对于肢体存活的重要性。2.观察到外周嵌合体是肢体移植后的普遍伴随现象，当排斥反应发生后，嵌合体消失。然而，在低剂量CsA维持下，移植肢体携带的骨髓细胞可向受体骨髓等中枢免疫器官迁移，维持长期嵌合状态，并进一步促进受体内供体特异性Treg的产生，诱导受体对供体特异性的免疫耐受状态。揭示了异体肢体移植过程中骨质成分作为VBMT诱导免疫耐受的机制，提示异体肢体移植可能是通过建立嵌合体诱导免疫耐受的特赦器官。3.证实BMSCs的免疫调节作用受IFN-γ等细胞因子的影响，并具有剂量依赖性。当将IFN预处理的BMSCs输注于异体肢体移植受体后，其发挥免疫调节作用，延长移植物的存活时间。4.通过RT-PCR、Western blot、流式细胞仪等技术，发现IFN-γ预处理BMSCs后其表面负性调节分子PD-L1上调，并抑制混合淋巴细胞反应活化T细胞的增殖、诱导其凋亡及向Treg的分化。结论在降阶梯的CsA免疫抑制方案下，异体肢体移植后可通过其携带的骨质成分实现VBMT，诱导中枢嵌合体的产生，进一步促进受体内供体特异性Treg的产生，诱导受体对供体特异性的免疫耐受状态。同时，IFN-γ预处理可以上调BMSCs表面负性调节分子PD-L1，抑制T细胞活化、诱导Treg分化，从而延长异体肢体的存活时间。