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研究背景:骨质疏松症是由多种原因引起的骨密度和骨质量下降的代谢性疾病,现全球骨质疏松的患者约2亿人,我国超过9000万患者,全球每年因骨质疏松导致骨折的患者约890万,每年用于骨质疏松治疗的医药费用约250亿元,这给患者带来严重痛苦,给家庭和社会带来沉重负担。因此,骨质疏松的预防和治疗是一项急需解决的医学问题。骨组织代谢平衡紊乱,破骨细胞骨吸收功能的异常,是导致骨质疏松的主要病理基础之一,因此,研究调控破骨细胞骨吸收功能的相关因子和信号通路,有助于深入了解骨质疏松的发病机制,对于骨质疏松的防治,具有重要的科学意义和医学价值。瞬时性受体电位通道香草酸受体（Transient Receptor Potential Vanilloid,TRPV）是一类钙离子转运蛋白。其家族共有六个成员,包括TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRVP4、TRPV5、TRPV6,其中TRPV5和TRPV6被称为高选择性钙离子通道蛋白,最近研究发现,TRPV6是破骨细胞上重要的钙离子通道,其可通过调节细胞内钙离子浓度,参与调控骨代谢功能,然而,TRPV6对骨代谢的调节作用仍存在争议,目前对TRPV6参与RANKL诱导的破骨细胞分化的研究还很少,其调控破骨细胞形成,骨吸收的分子机制尚不清楚。研究目的与方法:课题组前期成功建立了TRPV6基因敲除小鼠的动物模型,这为本课题的顺利开展提供了有利条件。本次研究从在体动物实验出发,利用Micro-CT扫描及三维重建,四环素双标和TRAP染色,酶联免疫吸附实验,蛋白质印迹实验等方法,阐明钙离子通道蛋白TRPV6对于小鼠骨代谢的影响;通过离体细胞实验,通过细胞TRAP染色,骨吸收陷窝实验,细胞免疫荧光实验,慢病毒转染,钙离子振荡实验,蛋白质印迹实验,实时定量PCR等相关实验方法,研究TRPV6在破骨细胞中的表达分布及其对破骨细胞的调控作用,并从分子水平,深入探索TRPV6调控破骨细胞形成,骨吸收的机制和相关信号通路。研究结果:我们的研究发现,12周龄TRPV6-/-小鼠可发生骨质疏松,Micro-CT扫描12周龄小鼠股骨样本,发现TRPV6-/-小鼠骨密度及骨小梁数量明显低于同龄普通野生型（WT）小鼠,CT三维重建可视TRPV6-/-小鼠股骨样本骨小梁变细,排列变稀疏。两组(WT和TRPV6-/-)小鼠股骨切片四环素双标染色未见明显差异,且Micro-CT扫描分析两组小鼠骨形成活力的指标无明显差异,提示TRPV6-/-小鼠成骨能力与普通野生型小鼠相比无明显异常。股骨切片免疫组化TRAP染色,TRPV6-/-小鼠染色面积明显大于对照组（WT组）,ELISA试剂盒检测发现,TRPV6-/-小鼠血清I型胶原交联C端肽（CTX-1）浓度明显高于对照组（WT组）,提示TRPV6-/-小鼠骨吸收能力强于对照组（WT组）,即TRPV6缺乏可引起小鼠骨吸收能力异常（增高）,导致骨质疏松。体外细胞研究发现,小鼠破骨细胞可表达TRPV6蛋白,且伴随着破骨细胞分化成熟的进程,TRPV6蛋白的表达量越来越低;通过细胞免疫荧光染色,可确定TRPV6主要分布在破骨细胞的细胞膜上,胞浆和胞核仅有少量分布。之后,课题组利用TRPV6-/-小鼠来源的原代破骨细胞,以及RNAi技术沉默普通小鼠来源破骨细胞的TRPV6基因,通过细胞形态学观察、TRAP染色、骨吸收陷窝实验,QT-PCR等检测方法,研究TRPV6对破骨细胞形成,骨吸收的调控作用,结果发现TRPV6可以负向调控破骨细胞形成,降低破骨细胞分化标志基因（CathepsinK、TRAP）和融合标志基因（Atp6v0d2、DC-STAMP）的表达,抑制骨吸收。为深入探索TRPV6负向调控破骨细胞形成的机制,我们通过钙离子振荡实验对可能参与其中的信号通路进行了初步筛选,发现沉默TRPV6基因不影响破骨细胞Ca2+振荡,证明TRPV6通过非Ca2+振荡/CaN依赖性通路抑制破骨细胞分化。IGF信号通路作为一条非Ca2+振荡/CaN依赖性信号通路,在破骨细胞的分化中起着重要作用。于是,课题组推测IGF可能介导TRPV6对破骨细胞形成,骨吸收的调控。结果证实,应用RNAi技术沉默TRPV6基因后,破骨细胞IGF1R mRNA和IGFBP1mRNA转录水平明显增高,且破骨细胞中IGF1R和IGFBP1蛋白表达量也明显升高,而阻断IGF信号通路可明显减弱TRPV6对破骨细胞形成的抑制作用。PI3K-AKT通路是IGF信号通路下游的信号途径之一,为明确该条通路是否参与TRPV6对破骨细胞形成的负向调控,课题组对此条通路进行了验证。结果提示,TRPV6可抑制破骨细胞PI3K-AKT途径中P85/p-P85、PDK1/p-PDK1和AKT/p-AKT的蛋白表达,加入拮抗剂NVP-AEW541阻断IGF1R后,TRPV6对上述通路中磷酸化标志蛋白的抑制作用消失,提示TRPV6通过抑制IGF1R-PI3K-AKT通路负向调控破骨细胞形成和骨吸收。结论:综上所述,本次研究,我们结合在体动物实验和体外细胞实验,发现TRPV6对小鼠骨代谢具有重要的调节作用,TRPV6基因敲除小鼠发生骨质疏松的主要原因是骨吸收功能异常导致,TRPV6是破骨细胞重要的调节因子,具有负向调控破骨细胞形成,骨吸收的作用,该作用主要依靠非Ca2+振荡/CaN依赖性通路介导,TRPV6通过抑制IGF1R-PI3K-AKT信号通路,负向调控破骨细胞形成,骨吸收。