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本研究优化了SRAP-PCR反应条件,用SRAP标记技术构建了23个怀地黄品种的指纹图谱,研究了23个怀地黄品种间的遗传多样性及品种鉴定,为地黄品种的鉴定、种质资源保护、杂交育种的亲本选配和开发利用提供理论和技术依据。本论文的主要研究内容和结果如下:
1、建立了地黄的SRAP反应体系和扩增程序。PCR反应体系:反应总体积为25μL包括:1×buffer扩增缓冲液,2.0 mmol/LMg2+,0.36μmol/L引物,0.30 mmol/LdNTPs,20 ng模板DNA和2.5 UTaqDNA聚合酶;扩增程序为:94℃预变性3 min后,前5个循环为94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,后35个循环将退火温度提高到50℃,其它条件不变,最后72℃延伸7 min。
2、用SRAP分子标记研究了怀地黄品种遗传多样性和亲缘关系。从288对引物组合中筛选出13对能够扩增出清晰而稳定条带的引物,用于扩增23个怀地黄品种基因组DNA,共扩增出338条谱带,其中多态性条带310条,平均多态性比率为91.71%,有效等位基因数为1.3229,杂合度为0.2008,Shannon多样性指数为0.3217,遗传相似系数在0.335-0.703之间,平均遗传相似系数为0.518。根据23个品种的Jaccard相似系数,进行聚类分析,绘制树状图,将23个品种划分为4个类群。三个北京系列和野生1号、9104、9302、串地龙、金状元、85-5、武陟1号、农家、小黑英聚为A类,野生2号独自聚为B类,武陟系列中除武陟1号外其余8个武陟品种和生津1号聚为C类,金皇后单独聚为D类。主成分分析结果支持这一聚类结果。聚类图可将本研究23个地黄品种分为两个类群,外部形态特征相近的品种基本聚在一起。
3.利用23个怀地黄品种的SRAP指纹图谱,获得特异的DNA片段标记,进行了品种分子鉴定。7对引物组合共鉴定出14个地黄品种。其中em3/me17引物组合鉴定出金皇后(700bp)、9302(170.bp)、农家(20.bp)、野生2号(160.bp)、武陟5号(520bp、220 bp)、武陟9号(140.bp),em8/me18引物组合鉴定出北京1号(530 bp)、武陟3号(490 bp)、武陟5号(590 bp)、武陟6号(520 bp)、武陟7号(40.bp),em12/me18引物组合鉴定9104(270 bp)、北京2号(60.bp)、野生2号(265 bp、420 bp、590 bp)、武陟5号(490 bp)。丰富了地黄品种鉴定的方法。
综上所述,SRAP标记技术用于怀地黄品种遗传多样性评价、亲缘关系分析和品种鉴定是可行的。