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一、背景脓毒症是临床常见危重急症之一,是机体对感染的反应失调,产生危及生命的器官功能损害。由于宿主免疫反应失衡,机体试图消除侵袭性微生物,大量炎性介质释放导致全身性炎症反应综合征(SIRS),继续发展为多器官功能障碍综合征(MODS),甚至死亡。严重烧伤患者由于广泛坏死组织的存在和病原微生物的侵袭使机体促炎性细胞因子的表达增多,从而释放大量炎性介质,引发全身性的炎症反应,同时也造成脏器的损伤,脓毒症是大面积深度烧伤患者的最常见死亡原因。二、目的观察Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)在烧伤脓毒症小鼠肠组织中的活化情况,并采用Btk特异性抑制剂(LFM-A13)进行干预,探讨Btk信号通路在烧伤脓毒症肠损伤的作用和分子机制。三、方法实验将80只雄性C57小鼠随机分为4组。分别为假手术组(SHAM组)8只,烫伤组(BURN组)8只,烫伤+LPS组即烧伤脓毒症组(SEP组)32只,烫伤+LPS+Btk特异性抑制剂(LFM-A13)组32只。均予以备皮,麻醉。BURN组,SEP组以及LFM-A13组小鼠的背部用水浴(100℃)恒温持续接触15s,计算烫伤面积10%TBSAⅢ度;通过腹腔注射LPS10mg/kg,制备小鼠脓毒症模型。LFM-A13组在烫伤后立即于腹腔注射LFM-A13(10mg/kg BW)。SHAM组麻醉后处死,BURN组烫伤后24h处死,SEP组及LFM-A13组分别于0h、8h、12h和24h后处死,每个时相点均为8只动物。小鼠处死后,迅速将小肠组织取出并于液氮冻存,采用Western blot方法检测肠组织Btk总蛋白和磷酸化蛋白表达。HE染色光镜下观察肠组织病理学改变并进行评分;TUNEL法检测细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI);酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清及小肠组织中IL-4、IL-6和TNF-α水平以及髓过氧化物酶(MPO)活性。四、结果Western结果显示,假手术(SHAM)组和10%TBSAⅢ度烫伤(BURN)组小鼠肠组织中Btk蛋白的表达水平表达无明显变化,而10%TBSAⅢ度烫伤+LPS诱导的烧伤脓毒症(SEP)组小鼠肠组织中的Btk蛋白在不同的时间点(0h、8h、12h、24h)的表达水平亦无明显变化,即Btk蛋白表达水平在不同组的表达水平均无明显变化。同法进一步检测各组小鼠肠组织中phospho-Btk(磷酸化Btk)蛋白的表达情况,结果显示SHAM组及BURN组小鼠肠组织p-Btk蛋白表达水平亦较少,而SEP组的p-Btk蛋白表达水平随着时间的推移亦呈现出持续升高的趋势,在12h达到高峰,随后下降,SEP组24h较12h的肠组织p-Btk蛋白表达亦略有下降。烫伤+LPS+Btk特异性抑制剂(LFM-A13)小鼠肠组织中的Btk蛋白表达水平无明显变化,而该组p-Btk蛋白随着时间推移呈现出持续升高的趋势,在12h达到高峰,24h较12h的肠组织p-Btk蛋白的表达略有下降。与SEP组相比,除了0h外,在相应时间点(8h、12h、24h)的p-Btk蛋白表达水平均有明显降低。另外,小鼠肠组织病理学变化HE染色结果可见,10%TBSAⅢ度(BURN)组与SHAM组未见明显病理改变,可见腺体排列紧密,上皮细胞成柱状排列整齐,可见丰富的杯状细胞,而有LPS诱导的烧伤脓毒症(SEP)组则有明显病理改变,可见肠上皮变薄,水肿明显,部分腺体萎缩以及杯状细胞减少或消失,且随着时间点往前推移其损伤程度逐渐加重;而LFM-A13组HE染色结果也可除0h时间点外,看出相应时间点病理学改变均较相应的SEP组轻。我们还采用TUNEL法检测肠上皮细胞的凋亡情况以及凋亡指数,假手术(SHAM)组肠组织的切片视野中基本未见已凋亡细胞;烫伤(BURN)组可见少量凋亡细胞;烧伤脓毒症(SEP)可见较多凋亡细胞,且随着时间点的推移凋亡细胞继续增加。LFM-A13组与SEP组相应时间点相比棕色颗粒即凋亡细胞明显减少,凋亡指数(AI)显著下降。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血清及肠组织中抗炎性细胞因子IL-4,促炎性细胞因子IL-6,TNF-a表达水平以及髓过氧化物酶(MPO)的活性,烧伤脓毒症(SEP)组血清中的炎性因子水平的表达明显高于其余两组,而LFM-A13组与SEP组相比,除了烧伤后0h之外,其余相对的应时间点的血清中炎性指标的水平均显著降低。同样,实验结果证实,在肠组织中的炎性细胞因子的水平变化与其在血清中的水平表达变化基本一致。同样,SEP组肠组织MPO活性明显高于其余两组,与SEP组相比,除了烧伤后0h不具有显著差异之外,LFM-A13组其余相对的应时间点的肠组织MPO活性均显著降低。五、结论Btk信号通路介导了机体抗炎性细胞因子IL-4,促炎性细胞因子IL-6和TNF-a的产生,参与肠道氧化应激,介导肠道细胞凋亡,在烧伤脓毒症肠损伤的发生发展中发挥着重要的调控作用。