半纤维素是植物细胞壁的重要成分,在自然界中碳水化合物拥有量仅次于半纤维,是一种重要的可再生能源,其中木聚糖是半纤维素的重要的组成成分。但木聚糖的结构十分复杂,其降解过程需要多种酶协助作用,其中木聚糖酶能够将木聚糖水解成不同长度的木寡糖和少量的木糖。因此,木聚糖酶能够将半纤维素降解成可以被利用的小分子物质,提高其利用效率,是降解半纤维素的限制酶。木聚糖酶在工业生产领域被广泛地使用。然而木聚糖酶活性低,性质不稳定等因素限制了其在工业上应用。近几年来,提高木聚糖酶的活性和稳定性成为全球的热点,其中构建基因工程菌是其中的途径之一。木聚糖酶在工业上具有广泛的应用前景,但是由于工业生产环境中的高温容易造成酶失活,工业上对酶的耐热性和稳定性要求越来越高。嗜热菌所产生的耐热酶在解决酶失活方面有着广阔的前景。本文利用实验室从温泉中分离出来的产耐热酶的菌株和克隆出来的耐热木聚糖酶基因,结合分子生物学和基因工程技术,将耐热木聚糖酶克隆到毕赤酵母中,构建出能适应工业生产环境产耐热木聚糖酶的工程菌。在结论如下:测序结果表明,利用pGEX-4T-2-XynF和pGEX-4T-2-XynR合成的木聚糖酶基因是一个1204bp的开放阅读框,编码407个氨基酸。木聚糖酶XynA基因的信号肽在第28个氨基酸和第29个氨基酸之间。在蛋白质合成过程中,信号肽是合成胞外蛋白质的信号,然而由于pPIC9K载体本身就具有合成胞外蛋白质的信号,因此利用利用pPIC9K-XynF和pPIC9K-XynR合成木聚糖酶基因片段大小大约为1080bp。由于pPIC9K载体大小约为9300bp,pPIC9K-XynA重组质粒大小约为10320bp。经线性化后通过点击转入到毕赤酵母,通过MD培养基和PCR方法可以筛选出阳性克隆子。通过序列比较发现,在毕赤酵母表达的木聚糖酶基因与在大肠杆菌表达的木聚糖酶的相似性大约为93%。毕赤酵母AOX1基因启动子可以用来调控外源基因的表达,甲醇是醇氧化酶AOX1基因启动子的诱导物,通过对产酶条件的分析发现,在温度为30℃,pH为4,诱导物浓度为1%,诱导时间为72h时酶活到达最大。由于大肠杆菌表达系统产生的木聚糖酶为胞内酶,因此纯化过程中要通过超声波破壁过程使木聚糖酶从胞内释放出来,在利用GST纯化柱获得电泳纯的木聚糖酶。而毕赤酵母表达系统产生木聚糖酶为胞外酶,纯化过程比大肠杆菌简单。只需通过硫酸铵,G-25和G-75等步骤获得电泳纯的木聚糖酶,并且G-25和G-75可以重复利用。相比而言,毕赤酵母系统比大肠杆菌系统具有更大的应用价值。木聚糖酶的酶谱图像发现,在大肠杆菌中表达的木聚糖酶大小约为48 KD,而在毕赤酵母中表达木聚糖酶约为55KD。这是因为在毕赤酵母表达蛋白质过程中存在糖基化过程。通过酶学性质的研究发现,毕赤酵母表达的木聚糖酶活性比大肠杆菌表达的木聚糖酶活性高。另外,整体上用毕赤酵母表达的木聚糖酶对外界环境的抵抗能力要比大肠杆菌表达的木聚糖酶强。这可能是由于毕赤酵母在表达过程中会对蛋白质进行修饰。