捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属（Haemonchus）的胃肠道寄生性线虫。该病原体主要寄生在反刍动物的皱胃中，以吸食宿主胃肠道壁粘膜和血液为生，造成宿主的贫血、腹泻、衰弱甚至死亡。天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Aspartyl protease inhibitor，API)指能够特异性地抑制天冬氨酸家族蛋白酶水解活性的一类物质的总称，通过控制水解酶类的活性来参与机体多种生理反应的调控。研究表明寄生虫蛋白酶抑制剂除了有抑制活性之外，在寄生虫的个体发育、宿主入侵、逃避免疫反应和调节免疫应答等方面均有重要作用。对寄生虫蛋白酶抑制剂的研究可以阐明寄生虫的发育和与宿主的相互作用关系，并对研制能够使寄生虫变得对宿主肠道蛋白酶更加易感的药物和疫苗提供思路。　　本研究首先对捻转血矛线虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂进行了克隆表达，而后测定了重组蛋白的抑制活性并分析了其阶段差异性表达情况，对雌虫、雄虫虫体中天然蛋白的组织定位进行分析，研究了该重组蛋白对山羊外周血单个核细胞(PBMC)细胞因子表达情况的变化。　　1.API的克隆及原核表达　　根据捻转血矛线虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因序列设计1对特异性引物，通过RT-PCR反应从成虫总RNA中扩增API基因。将此基因片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析;构建原核表达质粒pET32/API并转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后经SDS-PAGE分析其表达情况，并对重组蛋白进行Western blot分析。结果表明RT-PCR反应扩增出大小约为681bp的DNA片段，SDS-PAGE电泳结果表明该基因在细菌上清和包涵体中均有表达，相对分子量约为43×103，Western blot结果显示人工感染的山羊血清能够识别该重组蛋白。　　2.重组API的酶抑制活性　　将重组API蛋白与胃蛋白酶等质量混匀，37℃孵育30min，接着加入底物血红蛋白，继续孵育30min，通过SDS-PAGE电泳观察底物水解情况的变化来分析重组API抑制胃蛋白酶的水解作用。应用比色法测定重组API对胃蛋白酶的酶活性抑制率及最佳抑制温度。结果表明重组API蛋白能够显著抑制胃蛋白酶的活性，其最高抑制率为63％，最佳抑制pH及温度分别为pH4.0及37℃～50℃;SDS-PAGE分析结果表明加入重组API可以使底物血红蛋白水解不完全，而重组API对胰蛋白酶的水解能力没有抑制作用。以上结果说明重组API蛋白对天冬氨酸蛋白酶家族的胃蛋白酶具有抑制作用。　　3.捻转血矛线虫API基因的阶段表达特性分析　　分别提取捻转血矛线虫虫卵、L3、活化L3、雌虫成虫、雄虫成虫总RNA，然后反转录为cDNA;依据捻转血矛线虫API基因及β-Tubulin基因序列设计荧光定量引物，通过验证引物的扩增效率选择符合要求的引物进行荧光定量PCR反应。以β-Tubulin为内参基因，应用SYBR GREEN染料法进行荧光定量PCR分析API基因在捻转血矛线虫虫卵、L3期幼虫、活化L3期、雌虫成虫、雄虫成虫中的相对表达量。结果显示API基因在雌虫成虫中的表达量最低;在活化L3期幼虫中的表达量约为雌虫的10倍;在L3期的表达量最高，约为雌虫表达量的43倍。　　4.API蛋白在捻转血矛线虫雌、雄成虫中的定位　　制备大鼠抗重组API蛋白抗体，从感染山羊皱胃中挑取捻转血矛线虫成虫制作冰冻切片，用免疫组化技术研究API蛋白在雌虫、雄虫虫体组织中的分布情况。结果发现API在雌虫、雄虫体内均有分布，且主要分布位置集中在皮下组织及肠道中，但在雄虫体内的蛋白丰度较高，雌虫肠道组织中API的表达量较微弱。　　5.重组API对山羊PBMC表达细胞因子的影响　　分离山羊PBMCs，以梯度浓度（0，10，20，40μg/mL）的重组API蛋白刺激，置于37℃细胞培养箱中作用24小时。收集经API处理过的PBMCs，提取PBMCs总RNA，反转录成cDNA。以荧光定量PCR的方法对各组中IL-2，IL-4，IL-10，IL-17，TGF-β，IFN-γ等细胞因子的转录水平进行分析。结果表明IFN-γ的转录水平显著上升，IL-4和IL-10的转录水平也有不同程度的上升，其他细胞因子的转录水平变化不明显。