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研究背景:化疗是进展期非小细胞肺癌重要的治疗手段,但是长期的治疗受到化疗耐药的制约。近来研究表明非编码小分子RNA(miRNA)与肿瘤耐药的形成有关。微RNA (microRNA,miRNA)是近年来在真核生物中发现的、在转录后水平负调控基因表达的一类长约22个核苷酸的非编码小分子RNA。miRNA生物学效应广泛,与细胞生长、凋亡、新陈代谢和信号转导等密切相关。miRNA被报道在各种肿瘤中表达失常,可能发挥着癌基因和抑癌基因的双重作用。现在越来越多的研究表明miRNA在调节肿瘤细胞对抗肿瘤药物耐药方面发挥着重要作用,如果miRNA影响药物吸收、代谢、分布的通道上的基因表达及靶向参与临床功能的受体有可能导致肿瘤耐药。为了研究miRNA是否参与抗肿瘤顺铂耐药的形成,本实验通过miRNA芯片技术筛选肺癌耐药细胞株与非耐药细胞株差异表达的miRNA,利用荧光定量PCR技术验证相应miRNA的表达情况,通过在细胞株中抑制或者过表达目标miRNA,研究其对化疗药物敏感性的影响,探索以miRNA为靶点逆转肿瘤耐药的治疗及为预测肿瘤化疗敏感性提供新的标志物。研究方法:1细胞培养人非小细胞肺癌A549、A549/DDP细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI培养液中,在37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养,其中A549/DDP培养基含有1μg /ml的DDP以维持其耐药性。2检测DDP作用两个细胞株的IC50通过递增DDP浓度检测A549、A549/DDP两个细胞株的IC50,使用细胞计数试剂盒CCK8检测细胞的活力。酶标仪检测450nm波段的吸光值。3 miRNA表达芯片检测及数据分析在细胞生长融合度70%-85%时,按说明书使用Trizol提取A549和A549/DDP的总RNA。μParaflo? microRNA微阵列基因表达实验和分析由LC Sciences公司提供。4 quantitative RT-PCR验证芯片结果提取A549和A549/DDP的总RNA,使用TaKaRa逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA,定量PCR反应使用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix在ABI 7500系统平台上进行。5 miRNA转染效率的检测通过对耐药细胞转染miRNA模拟物或者抑制剂调控miRNA的表达,荧光定量PCR检测目标miRNA在细胞中的表达情况,研究能否高效调控miRNA的表达。6检测A549/DDP细胞改变miRNA表达后对DDP敏感性的影响对DDP耐药细胞A549/DDP转染miRNA模拟物或者抑制剂,模拟物、抑制剂的终浓度分别为50nM、100nM, NC为转染阴性对照,转染48小时后,使用CCK8检测细胞对DDP的敏感性,检测波长为450nm。7统计学分析功能实验的结果用均数±标准差表示,组间差异用one-way ANOVA检验,IC50应用probit回归模型进行计算。统计软件软件采用SPSS15.0,以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准。研究结果:1、DDP对A549和A549/DDP细胞的IC50分别为0.48ug/ml、8.64ug/ml,A549/DDP的IC50是A549的18倍。2、miRNA芯片结果显示耐药细胞株与非耐药细胞株的miRNA表达差异显著,在A549/DDP细胞表达上调最大和下调最大的miRNA分别为miR-376c和miR-451。3、实时荧光定量PCR显示,以A549细胞为对照组,在A549/DDP中miR-376c,miR-31、miR-29a、miR-221高表达倍数分别为3.5、2.5、2.2、3.1倍,miR-451、miR-196a,miR-20a ,miR-20b,miR-17低表达倍数为3.2、4.9、3.0、7.7、71.4倍。4、经转染miR-376c的抑制剂后,miR-376c在细胞中的表达水平下降了97.3%,转染miR-451的模拟物后,miR-451的表达水平上调了1528倍。5、提高miR-17的表达后,细胞对DDP的敏感性提高了11.7%,而增加miR-451的表达或者抑制miR-29a的表达则会导致细胞对DDP的敏感性下降,降幅分别为15.5%、12.9%,而分别抑制miR-376c,miR-31,miR-221或者过表达miR-196a、miR-20b、miR-20a均不影响细胞对DDP的敏感性。结论:1、非小细胞肺癌顺铂耐药细胞与非耐药细胞的miRNA表达谱差异显著。2、miRNA芯片是筛选差异表达miRNA的有效工具。3、miRNA抑制剂和模拟物可以在细胞中高效调控目标miRNA的表达水平。4、过表达miR-17能提高肺癌细胞对顺铂的敏感性,而过表达miR-451或者抑制miR-29a的表达则导致肿瘤细胞对顺铂敏感性下降,miR-17具有逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的潜力。