论文部分内容阅读
第一部分FOXD3基因真核表达载体构建及其在神经母细胞瘤细胞株中的表达目的：构建携带有外源性人FOXD3基因的真核表达载体，并瞬时转染神经母细胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC细胞株，观测瘤细胞中FOXD3过表达，为后续实验做准备。方法：运用基因工程方法构建FOXD3真核表达载体，转染体外培养的神经母细胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC细胞株，两种细胞系均分为三组，即空白对照组（control）、空白质粒组（plasmid negative control, PNC）及目的质粒组（FOXD3+），采用荧光显微镜观测转染效率，运用western blot和real-time PCR方法检测瘤细胞中FOXD3蛋白和mRNA过表达水平。结果：构建了FOXD3基因的真核表达载体；两种细胞系空白对照组均无荧光，PNC及FOXD3+组细胞均有绿色荧光，且两组荧光亮度及密度相近，经细胞计数分析转染效率达70%-85%。两种细胞系空白对照组和PNC组FOXD3蛋白及mRNA的表达水平低下，SK-N-SH及SK-N-MC细胞的FOXD3+组FOXD3蛋白表达水平较PNC组分别升高5.78倍（P<0.05）、6.39倍（P<0.05），FOXD3mRNA表达水平分别增高20.362倍（P<0.05）、23.652倍（P<0.05）。结论：成功构建了FOXD3基因的真核表达载体，能介导FOXD3基因在神经母细胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC细胞株中过表达，为后续研究奠定了基础。第二部分FOXD3基因过表达对神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡的影响目的：探讨FOXD3基因过表达对神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法：神经母细胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC细胞均分为空白对照组（control）、空白质粒组（plasmid negative control, PNC）及目的质粒组（FOXD3+），转染48h后运用MTT、EdU、克隆形成、软琼脂实验等方法检测细胞增殖，采用Annexin V-碘化丙锭（PI）双标流式细胞术检测细胞凋亡。结果：在SK-N-SH及SK-N-MC细胞中，各自的PNC组与空白对照组相比细胞增殖率无显著性差异（P>0.05），而FOXD3+组与PNC组相比增殖率均有明显下降。MTT比色法显示SK-N-SH及SK-N-MC细胞增殖率分别下降了31.7%（P<0.05）、26.9%（P<0.05）；EdU掺入法显示SK-N-SH及SK-N-MC细胞增殖率分别下降了28.4%（P<0.05）、24.3%（P<0.05）；克隆形成、软琼脂实验结果显示：与各自的PNC组相比，FOXD3+组形成的单克隆细胞集落数量明显减少，且细胞团或细胞球的直径显著减小。流式细胞术结果显示：与空白对照组相比，SK-N-SH及SK-N-MC的PNC组细胞凋亡率无显著性差异（P>0.05），而FOXD3+组细胞凋亡率分别升高了1.7倍（P<0.05）、1.5倍（P<0.05）。结论：FOXD3基因过表达可显著抑制神经母细胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC细胞增殖，诱导其凋亡。第三部分FOXD3基因过表达对神经母细胞瘤细胞侵袭迁移、血管生成的影响目的：探讨FOXD3基因过表达对神经母细胞瘤细胞侵袭迁移、血管生成的影响。方法：神经母细胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC细胞均分为空白对照组（control）、空白质粒组（plasmid negative control, PNC）及目的质粒组（FOXD3+），转染48h后运用Transwell实验检测瘤细胞侵袭迁移能力；运用培养转染细胞的上清液培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），观察其小管形成能力；运用real-time PCR和western blot方法检测细胞中N-myc及其下游基因NDRG1的mRNA和蛋白表达水平。结果：SK-N-SH及SK-N-MC细胞转染FOXD3基因48h后，与空白对照组相比，PNC组细胞侵袭迁移能力无显著变化(P>0.05)，而FOXD3+组细胞侵袭迁移能力分别下降了34.3%（P<0.05）、29.4%（P<0.05）；与PNC组相比，FOXD3+组细胞血管生成能力显著下降，生成血管的直径较小且成环率降低；与空白对照组相比，PNC组瘤细胞N-myc及NDRG1的mRNA表达无显著差异(P>0.05)，而FOXD3+组细胞N-myc mRNA表达水平分别下降26.2%（P<0.05）、24.1%（P<0.05），而NDRG1的mRNA表达水平分别上升约1.8倍（P<0.05）、1.7倍（P<0.05）；western blot检测结果显示：与空白对照组相比，PNC组瘤细胞N-myc及NDRG1蛋白表达无显著差异(P>0.05)，FOXD3+组细胞N-myc蛋白表达分别下降22.3%（P<0.05）、20.8%（P<0.05），而NDRG1蛋白表达分别升高1.5倍（P<0.05）、1.4倍（P<0.05）。结论：FOXD3基因过表达能显著降低SK-N-SH及SK-N-MC细胞的侵袭迁移及血管生成能力，抑制其转移，其可能机制是通过下调N-myc表达，从而上调NDRG1表达。