论文部分内容阅读
研究背景:食管癌是全球第八大最常见的恶性肿瘤,在所有肿瘤中死亡率位居第六位。食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌最主要的组织学亚型。在发展中国家,约90%食管癌组织学类型为食管鳞癌。尽管近年来食管鳞癌的诊断方法及治疗技术取得了极大的进步,食管鳞癌患者的5年生存率仍然低至5%-400%。牛痘相关激酶1(vaccinia-related kinase 1,VRK1)是丝氨酸-苏氨酸激酶VRK家族中的一员,它主要参与细胞分裂,转录激活,DNA修复和组蛋白修饰。许多恶性肿瘤中都存在VRK1的异常上调,高水平的VRK1常与肿瘤细胞高增殖活性相关。尽管先前研究表明VRK1在食管鳞癌中表达升高,但VRK1在食管鳞癌中所发挥的具体生物学功能仍然不清楚。本研究以VRK1在食管鳞癌中的作用及机制为主要方向,探讨VRK1在食管鳞癌中的表达情况,分析其对食管鳞癌细胞生物学功能的影响,并进一步就VRK1参与食管鳞癌发生发展中的具体机制进行研究。研究目的:本研究旨在探讨VRK1在ESCC中的表达水平及对ESCC细胞的生物学行为的影响,进一步研究VRK1在食管鳞癌发生发展中的重要作用及相关机制。为改善ESCC患者的预后、寻找新的基因靶点以及精确预后评估提供实验基础和理论依据。材料与方法:1.病例选择及标本收集;2.RNA提取及实时荧光定量聚合酶链式反应;3.蛋白提取及蛋白免疫印迹;4.免疫免疫组织化学染色;5.细胞培养;6.载体的构建及转染;7.小RNA转染;8.双荧光素酶报告基因;9.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;10.CCK-8实验检测细胞活性;11.Transwell细胞迁移及侵袭实验;12.集落形成实验;13.划痕实验;14.构建食管鳞癌动物模型体内检测VRK1对食管鳞癌生长的影响;15.统计学分析。结果:1.通过对41例ESCC患者组织样本进行RT-PCR分析,结果表明VRK1在食管鳞癌组织中的表达水平显著高于在癌旁正常组织(P<0.01)。与食管正常表皮细胞(Her-la及HECC)相比,食管鳞癌细胞株(Eca109,Kyse150,Ec9706)中VRK1的表达水平显著升高(P<0.01)。半定量免疫组织化学染色结果显示,在纳入的132例食管鳞癌患者标本中,VRK1阳性率为59.84%(79/132例)。统计学分析显示VRK1表达水平与肿瘤浸润深度,淋巴结受累以及TNM分期相关(P<0.01)。Kaplan-Meier和log-rank分析表明VRK1高表达与预后不良相关(P<0.01)。单变量及多变量Cox回归分析表明VRK1表达水平、T分期和N分期为ESCC的独立预后因素(P<0.01)。2.VRKl-RNAi慢病毒和阴性对照病毒分别转染上述三种食管鳞癌细胞,与对照组相比,转染了 VRK1 RNAi慢病毒的细胞增殖及集落形成能力明显降低,凋亡增加,迁移和侵袭能力增强。相反,在食管鳞癌细胞中转染VRK1过表达质粒可明显增强细胞的增殖及集落形成能力,抑制细胞凋亡并促进细胞的迁移和侵袭。3.在食管鳞癌细胞中过表达VRK1显著增加了细胞对顺铂的耐受性,而沉默VRK1使食管鳞癌细胞对顺铂变得敏感。裸鼠移植瘤实验表明,与对照组相比,转染VRK1 RNAi慢病毒的肿瘤细胞对顺铂敏感性明显增高,而转染了 VRK1过表达质粒的肿瘤细胞对顺铂的耐药性增强。4.免疫印迹实验表明在食管鳞癌细胞中VRK1促进c-Jun的磷酸化。此外,磷酸化的c-Jun促进ESCC细胞增殖、抑制凋亡并降低细胞对顺铂的敏感性。靶向抑制c-Jun可阻断VRK1对食管鳞癌细胞所施加的生物学效应。5.免疫印迹实验及RT-PCR表明在食管鳞癌细胞中沉默c-Jun可降低c-MYC的表达。此外,沉默VRK1抑制c-MYC的表达。双荧光素报告系统实验表明沉默c-Jun可显著降低c-MYC启动子的活性,提示c-Jun在转录水平调节c-MYC的表达。c-MYC减弱了食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性。6.Luteolin(VRK1的抑制剂)可剂量依赖性地抑制食管鳞癌细胞的增殖、集落形成、侵袭及迁移并显著促进细胞凋亡。Luteolin可抑制c-Jun的磷酸化并进而抑制c-MYC的表达。免疫印迹及CCK-8实验表明,Luteolin可增强顺铂对食管鳞癌细胞的细胞毒作用。体内实验证实,Luteolin处理组小鼠肿瘤体积明显小于生理盐水处理组。7.对132例ESCC患者组织的免疫组织化学染色表明VRK1表达水平与c-MYC表达水平显著相关(P<0.001)。Kaplan-Meier分析显示低VRK1/低c-MYC组患者的总生存期及无病生存期与其他组相比明显较高,而高VRK1/高c-MYC组患者的预后较其他组相比明显较差。研究结论:本研究表明VRK1在食管鳞癌中表达增高并且与临床病理学特征密切相关。VRK1促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭并增强对顺铂的耐药。VRK1可通过激活c-Jun上调c-MYC的表达,并通过c-Jun/c-MYC通路介导顺铂耐药。VRK1的抑制剂可通过抑制VRK1在体内、体外发挥抑制食管鳞癌发生发展的作用。本研究首次阐明VRK1在食管鳞癌发生发展中的关键作用,提示VRK1可作为靶向治疗食管鳞癌的有效靶点。