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背景肺癌（Lung cancer）是最常见的恶性肿瘤之一,已成为全球范围内恶性肿瘤致死的首要原因。肺癌转移是临床患者治疗失败的主要原因。中医药可通过调控遗传学、表观遗传学、肿瘤微环境和癌症干细胞等方面发挥抗癌活性。我们前期实验发现跨膜卷曲螺旋结构域1（Transmembrane and coiled-coil domains 1,TMCO1）在肺腺癌原发灶及转移灶中表达升高,敲除TMCO1能够抑制肺腺癌A 549细胞活力及迁移力。进一步转录组测序发现,TMCO1与发育、肿瘤转移侵袭、干细胞、肿瘤血管生成、上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）、TGF β、PI3K/Akt、HIFl α等多种生物学过程和通路相关。固本解毒方是中国中医科学院广安门医院朴炳奎教授经过长期临床实践总结的经验方,该方可有效抑制肺癌转移,延长患者的生存时间,我们前期预实验发现固本解毒方能够抑制肺腺癌A549细胞活力及迁移力,并且可能与TMCO1有关,但值得进一步研究。第一部分基于网络药理学和分子对接初步分析固本解毒方抑制肺癌作用机制目的:预测固本解毒方抑制肺癌的作用靶点及通路方法:网络药理学方法和分子对接技术:通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中药高通量实验和参考数据库（HERB）、PubChem、SwissTargetPrediction、UniProt数据库筛选固本解毒方各药物活性成分及其作用靶点,通过Cytoscape3.8.0软件构建药物-活性成分-靶点网络。通过GEO、Genecards、OMIM、Malacards数据库获取肺癌相关靶点,并使用Venny数据库获得与固本解毒方的交集靶点。利用STRING数据库建立蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络,使用 Cytoscape3.8.0 软件中 CytoNCA插件筛选PPI网络核心靶点,利用DAVID6.8数据库进行GO分析和KEGG通路富集分析。Autodock vina软件进行分子对接,模拟主要活性成分与关键靶点的结合强度。结果:利用网络药理学预测到固本解毒方活性成分237种,药物与疾病交集靶点880 个,PPI 网络核心靶点有 AKTl、EGFR、TNF、IL6、STAT3、PIK3CA、mTOR等,GO分析显示生物学过程主要富集在蛋白酪氨酸/丝氨酸磷酸化和增殖、凋亡、炎症反应相关,KEGG通路富集分析发现固本解毒方治疗肺癌与调控癌症相关信号通路相关,尤其是PI3K/Akt信号通路。分子对接结果显示,固本解毒方主要活性成分与AKT1、PIK3CA、GSK-3 β具有很好的结合强度。第二部分固本解毒方抑制免疫缺陷小鼠转移瘤及其作用机制目的:验证固本解毒方抑制免疫缺陷小鼠肺腺癌转移瘤的作用及其机制方法:NSG鼠尾静脉注射人肺腺癌A549细胞,建立肺腺癌转移动物模型。实验分为空白组、模型组、固本解毒方高、中、低剂量组、阳性药组,分别给予生理盐水和固本解毒方高、中、低剂量中药灌胃,顺铂腹腔注射。给药23天后,取肺组织进行石蜡切片、HE染色、免疫组化检测β-catenin、vimentin、TMCO1、PI3K、Akt蛋白表达。结果:造模后各组小鼠精神状态良好,进食水正常。与模型组相比,固本解毒方组小鼠体质量稍有下降,阳性药组小鼠体质量下降明显。HE染色结果显示,与模型组相比,固本解毒方高中低剂量组肿瘤细胞数量均减少,排列成小巢团状或单个散在分布,部分细胞退行性变,以高剂量组抑制肿瘤转移效果最好,且伴有肿瘤细胞残影。免疫组化结果表明,与模型组相比,固本解毒方中剂量组β-catenin蛋白表达轻度升高（P＜0.05）,高剂量组和阳性药组明显升高（P＜0.01）;与模型组相比,固本解毒方中剂量组vimentin蛋白表达轻度降低（P＜0.05）,高剂量组和阳性药组明显降低（P＜0.01）;与模型组相比,固本解毒方中剂量组TMCO1蛋白表达轻度降低（P＜0.05）,高剂量组和阳性药组明显降低（P＜0.01）;与模型组相比,固本解毒方高剂量组和阳性药组PI3K蛋白表达降低（P＜0.05）;与模型组相比,固本解毒方中剂量组和高剂量组Akt蛋白表达轻度降低（P＜0.05）,阳性药组明显降低（P＜0.01）。第三部分固本解毒方含药血清抑制肺腺癌A549细胞转移及其作用机制目的:验证固本解毒方含药血清抑制肺腺癌A549细胞转移的作用及其机制方法:制备固本解毒方含药血清,实验分为A549细胞正常血清组（10%空白血清）、固本解毒方含药血清低中高剂量（2.5%、5%、10%）组、PI3K/Akt通路激活剂 SC79 组、高剂量+SC79 组、A549-TMCO1-29细胞组、A549-TMCO1-33 细胞组;MTT实验检测A549细胞存活率;划痕实验检测A549细胞迁移力;Western blot检测A549细胞蛋白表达,Real-time PCR检测A549细胞mRNA表达。结果:MTT和划痕实验结果表明,固本解毒方含药血清抑制A549细胞活力和迁移力（P＜0.05）。Real-time PCR结果显示,与正常血清组比较,固本解毒方含药血清组 N-cadherin、Vimentin mRNA 表达降低（P＜0.01）。Western blot 结果显示,与正常血清组比较,固本解毒方含药血清组E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、Vimentin、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β 表达降低（P＜0.05,P＜0.01）,说明固本解毒方含药血清抑制EMT和PI3K/Akt通路。进一步Rescue实验结果显示,与高剂量组比较,高剂量+SC79组E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Vimentin 蛋白表达升高,且 p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β表达升高（P＜0.01）,说明加入PI3K/Akt通路激活剂后,减弱了固本解毒方含药血清对EMT的抑制作用。此外,Western blot结果显示,与A549细胞组相比,A549-TMCO1-29细胞组和 A549-TMCO1-33 细胞组 E-cadherin 蛋白表达升高,N-cadherin、Vimentin、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达降低（P＜0.05,P＜0.01）,说明敲除TMCO1 抑制 EMT 和 PI3K/Akt 通路。结论1.通过网络药理学和分子对接,表明固本解毒方多成份多靶点的特点,PI3K/Akt信号通路可能是其发挥作用的主要通路之一。2.基于体内及体外细胞实验结果,固本解毒方通过TMCO1/PI3K/Akt轴抑制肺腺癌转移和上皮间质转化（EMT）。