研究背景随着人们健康保健意识的提高,逐渐意识到肥胖不单纯是体重超标,也是亚健康甚至是病态表现,同时也是II型糖尿病、心血管病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、骨质疏松、中风和癌症等多种疾病的高危诱发因素。引起肥胖的原因有很多。原因：运动不足、基因缺陷、营养过剩等。减肥、瘦身和纤体成为当今社会健康保健和临床医学、美容的时髦话题。目前的减肥方法有很多,比如针灸疗法,运动疗法、药物的疗法等。但是这些治疗的方法在不同程度上都存在一些条件局限性或对人们的健康造成危害。虽然运动疗法较为有效,但容易受到时间、空间、环境因素的制约。所以人们希望寻求一种更为安全、有效的减肥方法。上世纪80年代,美国科学家证实瘦索及其受体功能异常是导致部分人肥胖的罪魁祸首之一。瘦素(Leptin)基因也称OB基因(肥胖基因)、瘦素主要是由白色脂肪组织分泌,是反应体内脂肪储存和营养状况的信号。Leptin可影响机体的许多生理和代谢过程,参与糖、脂肪及能量代谢的调节,促使机体减少摄食,增加能量平衡。近年来,有研究者发现,注射瘦素可以治疗肥胖,但对瘦素受体功能异常或瘦素抵抗的患者是无效的。本课题组利用瘦素免疫SD大鼠,产生的瘦素抗体中和了内源性瘦素的作用,从而模拟了瘦素抵抗作用,大鼠出现了肥胖症状,促进脂肪沉积,减弱了胰岛分泌胰岛素的功能。Brown等[2]在远系杂交的小鼠中运用cDNA片断序列分析发现瘦素受体基因第12外显子一个鸟苷酸残基缺失,导致编码序列框架移码,使Leptin受体转导水平降低10倍,此位点为糖尿病位点的1个等位基因,小鼠出现糖尿病和肥胖。既然瘦素是通过激活位于细胞表面的瘦素受体发挥抑制脂肪沉积作用,本实验设想能否把瘦素受体作为肥胖、糖尿病治疗的新靶点。瘦素受体(leptin receptor)基因也称OBR基因。OBR在猪的多个组织器官上都有表达,如脑、小肠、卵巢、肾、脾、肝脏、垂体、心肌、肺等,其中下丘脑、肾脏、肝脏表达最强。瘦素只有与位于下丘脑及脂肪组织的OBR结合,才可发挥降低食欲、减少能量摄取、增加能量消耗、抑制脂肪合成的作用。已有研究表明利用受体蛋白片段免疫,产生的抗体可以结合到受体胞外区,并可能产生抑制或促进效应。根据不同的片段、不同的动物,抗体可能激活OBR转导途径而增强leptin功能的发挥,或者阻碍OBR转导途径而抑制leptin功能的发挥。如果抗体阻碍OBR转导途径而抑制leptin功能的发挥,可以促进脂肪沉积,导致动物肥胖及代谢综合症的发生。如果受体上某个区域肽片段产生的抗体激活OBR转导途径而增强leptin功能的发挥,抑制脂肪生长沉积,这将更好地改善动物肉质及控制肥胖。在畜牧业上利用瘦素受体重组融合蛋白免疫法调控畜禽生产育肥和增加瘦肉率已取得很好效果。施振旦[5]等把瘦素受体蛋白片段制成疫苗免疫鸡,采食量、体重、脂肪沉积降低。因此我们探讨是否可以利用瘦素受体抗体与瘦素受体特异性结合,来模拟瘦素加强瘦素受体及相关调控基因的功能,从而抑制脂肪沉积和血糖水平。瘦素通过与瘦素受体结合后发生一系列神经元反应,影响POMC基因与NPY基因表达,最终抑制食欲。POMC基因与NPY基因的生物学作用是相互拮抗的,因而它们对食欲的调控最为关键。另外,本课题还关注与脂肪代谢相关的两个基因PPARγ和UCP3,PPARγ对脂肪组织中甘油三酯水解的限速酶CPT-1进行转录调节。CPT-1的表达水平与体脂含量相关，表达水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低体脂肪沉积量。UCP3基因是脂肪代谢的候选基因，UCP3基因在脂肪代谢过程中,使得骨骼肌中乙酰辅酶A羧化酶浓度降低,这样降低骨骼肌丙二酸单酰辅酶A的浓度,从而从抑制状态释放CPT1,提高β氧化,从而完成其调节脂类代谢的功能。研究目的和意义肥胖是多种疾病的高危诱发因素。寻找减肥的方法已刻不容缓。美国科学家发现瘦素及瘦素受体功能异常是导致部分人肥胖的原因。Leptin可影响机体的许多生理和代谢过程,参与糖、脂肪及能量代谢的调节,促使机体减少摄食,增加能量平衡。Leptin通过激活位于细胞表面的受体OBR发挥抑制脂肪沉积的生物学作用。瘦素及瘦素受体功能异常可导致糖脂代谢的异常。在畜牧业上利用瘦素受体重组融合蛋白免疫法降低鸡体重、脂肪沉积降低已取得很好的效果。因而本课题利用瘦素体胞外进跨膜区重组融合蛋白主动免疫SD大鼠，探讨能否利用OBR抗体与OBR特异性结合的能力，来模拟Leptin加强OBR及相关调控基因的功能，从而抑制脂肪沉积和降血糖，为研发预防和治疗肥胖症及相关代谢疾病(Ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝等)药物奠定实验基础和理论依据。研究方法(1)表达载体的构建PCR扩增克隆瘦素受体胞外近跨膜区基因片段,并将其插入到大肠杆菌表达质粒pRSETA。(2)目的蛋白的表达、鉴定与纯化①表达：大肠杆菌BL21(DE3)株中用IPTG诱导各表达菌表达表达瘦素受体胞外近跨膜区重组融合蛋白；②鉴定：western-blotting定性检测纯化的瘦素受体胞外近跨膜区重组融合蛋白。③纯化：用50%Ni-NTA树脂利用亲和层析在变性条件下纯化目的蛋白,经尿素和pH梯度透析逐步除去尿素,并将蛋白溶解于PBS中。(3)目的蛋白大量表达,保存于-20℃备用。(4)疫苗的制备：按常规方法制成油乳剂疫苗。将大肠杆菌中表达并纯化瘦素受体胞外近跨膜区重组融合蛋白与矿物油等佐剂在匀浆器中混匀制备基因工程疫苗。(5)SD大鼠免疫实验挑选30只体重均匀、健康的40日龄SD大鼠♀,随机分为2组,每组15只,单笼饲养,预饲5d后进行正式实验。供试SD大鼠在整个实验期间给予普通鼠料,自由采食、自由饮水。实验全期按免疫次数分成3个阶段：以第一次免疫前一天记为第0天,于第1天进行第一次免疫,第20天、40天加强免疫。免疫采用腿肌两侧两点注射方法,处理组(OBR-a)每只每次免疫1mg瘦素受体胞外近跨膜区重组融合蛋白,对照组(KLH)免疫1mg KLH蛋白。分别在实验的第0、7、14、20、27、34、40、47天对大鼠进行采血和对采食量、体重和体长进行测定,并计算Lee’s指数(衡量大鼠肥胖程度的重要指标)。采血后分离血清用于抗体水平、血清葡萄糖、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、瘦素、胰岛素、胆囊收缩素的测定。第49天每组随机挑选6只大鼠进行耐糖量测试,在第50天时将所有大鼠安乐死,分离腹脂、肝脏称量鲜重并计算腹脂率、肝脏指数。采集肝脏检测组织甘油三酯含量。采肝脏制作冰冻切片(油红O染色)和采皮下脂肪制作石蜡切片(HE染色),胰腺制作石蜡切片后进行胰岛素免疫组化检测。采集下丘脑、垂体、腿部肌肉、肝脏进行脂肪沉积、摄食相关基因(UCP3、PPAR γ、 POMC、 NPY)的荧光定量PCR检测。Lee’s指数=[(体重g×103,)/体长cm]1/3腹脂率%=腹脂重量/体重×100%肝脏指数%=肝脏重量/体重×100%动物试验所得的所有数据用SPSS13.0统计分析软件处理。体重、采食量、体长、Lee’s指数采用two-way ANOVA进行统计分析；其他用平均数±标准差表示,采用Student’ sttest进行统计分析。P<0.05表示差异显著。实验结果与讨论通过提取西藏小型猪肝组织总RNA,反转录后进行OBR胞外近跨膜区基因片段PCR扩增并成功构建OOBR胞外近跨膜区原核表达载体；成功诱导表达纯化西藏小型猪OBR胞外近跨膜区蛋白。免疫SD大鼠后,体重、体长、Lee’s指数、腹脂率、肝脏脂肪沉积、胰岛素分泌、血糖、胰岛素、血脂四项与对照组无明显差异；而采食量显著增加(p<0.05)、皮下脂肪细胞体积缩小。另外,免疫OBR胞外近跨膜区重组融合蛋白组的大鼠血清中CCK的含量比对照组高,且差异显著(P<0.05):CCK生理功能是抑制食欲,与瘦素共同反馈调节下丘脑的饱食中枢。理论上实验组大鼠相对与对照组食欲应该更差。但实际情况并非如此,免疫OBR胞外近跨膜区重组融合蛋白组的大鼠采食量比对照组的高。瘦素通过与瘦素受体结合,发生一系列神经元反应,最终抑制食欲。本实验利用荧光定量PCR技术检测了免疫了OBR的SD大鼠体内最为关键的两个与食欲相关的基因——POMC和NPY。结果表明,免疫OBR-a后,SD大鼠POMC基因的表达量低于对照组,NPY基因表达量高于对照组。POMC基因与NPY基因的生物学作用是相互拮抗的,POMC基因表达越低与NPY基因表达越高,促进食欲的效果更好[8]。免疫OBR-a后,SD大鼠体内leptin含量降低会导致食欲的增加。这与本实验中对SD大鼠测定的采食量数据相吻合。免疫OBR-a后,在实验后期SD大鼠的采食量均高于对照组。免疫OBR-a后,皮下脂肪细胞体积缩小,另外荧光定量PCR结果显示,调控脂肪沉积的PPARγ和UCP3基因均上调,且PPARγ的表达量与对照组差异显著(p<0.05)。PPARγ是通过调控脂肪代谢过程中的某些酶的表达,促进脂肪的分解代谢。UCP3基因通过使呼吸链中的氧化与磷酸化作用解偶联,降低ATP合成效率,使贮存的能量以热能形式释放。两者最终都是促进代谢,减少脂肪沉积。这也与实验中统计到的腹脂肪率、皮下脂肪沉积数据一致。在实验第50天,对免疫OBR-a的SD大鼠腹脂进行分离,称重并计算腹脂率；对皮下脂肪进行HE染色,观察脂肪细胞大小变化。结果显示,免疫OBR-a的大鼠腹脂率、皮下脂肪细胞大小低于对照组。结论对SD大鼠免疫OBR-a后,产生了抗OBR-a抗体,促进了瘦素与瘦素受体的结合,进而促进了与脂肪代谢相关基因——UCP3和PPARγ的表达,促进了能量代谢,减少了脂肪沉积,导致体内leptin含量的降低,leptin含量的降低导致POMC基因表达的减少、NPY基因表达的增多,最终导致食欲的增强。若利用这些特点改进实验设计,在限饲(给予与对照组相同饲料量)即料重比降低的情况下,免疫瘦素受体体重可能会下降,在一定程度上达到减肥的效果,这为下一步研究OBR基因的功能、研究肥胖发病机制、探寻预防与控制肥胖方法提供有益的思路。