猪肺炎支原体的分离鉴定及其主要抗原蛋白基因的克隆与序列分析

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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumonia of swine, MPS)的主要病原体,也是猪呼吸道病综合征(Porcine RespiratoryDisease Complex,PRDC)的主要原发性病原之一。MPS广泛存在于世界各地,主要危害是引起猪咳嗽、喘气、生长受阻和饲料转化率大幅下降,严重影响养猪业的经济效益。为了进一步了解Mhp在广东的流行及主要抗原蛋白的变异情况,本研究从屠宰猪肺组织分离鉴定了一株Mhp,并观察其培养特性、致病性、抗菌药物敏感性。同时克隆分离株主要抗原蛋白基因P46、P65蛋白C末端和P97蛋白R1R2区编码序列,与国际标准株核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较,分析P46、P65和P97的抗原指数。研究结果报告如下。(1)本研究从100多份屠宰肺组织样品中分离到一株疑似Mhp,通过菌株的培养特性、形态观察、生化试验、血清学鉴定和P46基因序列分析证实该分离株为Mhp,命名为GDZJ01。(2)将分离菌株GDZJ01分别接种到牛心汤培养基、改良KM2培养基和改良Hayflick培养基中,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了GDZJ01在最适培养基中不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加15%马血清或20%猪血清的改良Hayflick培养基最适宜Mhp生长,生长滴度可达108CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养42h后进入稳定期,培养54h时后进入衰亡期。(3)通过卵黄囊接种,GDZJ01可在6日龄鸡胚生长繁殖,并致死鸡胚,说明GDZJ01具有一定致病性,但比标准株7448株弱。(4)MIC测定结果表明,分离株GDZJ01对大多数支原体治疗常用抗菌药物敏感性下降,对林可霉素、土霉素、氟甲喹、金霉素产生了耐药性,对环丙沙星、氟苯尼考、泰妙菌素、替米考星有较高敏感性。结果为指导临床用药治疗MPS提供了实验数据支持,提示了未来用抗菌药物预防和治疗Mhp感染将变得越来越困难。(5)采用常规方法,克隆了分离株GDZJ01的P46基因、P65基因的C末端和P97基因的C末端R1R2区域。结果表明,P46和P65基因高度保守,与标准株J株、232株和7448株的核苷酸序列同源性分别为98.9%-99.1%和99.2%-99.7%,氨基酸序列同源性分别为99.3%-99.5%和99.5%-100%;而P97基因变异较大,R1R2区域的核苷酸序列同源性为86.6%-96.0%,氨基酸序列同源性为89.0%-95.4%。抗原指数分析表明,分离株的P46、P65蛋白与标准株基本相同,但P97蛋白与标准株存在明显差异,且R1和R2区中包含的氨基酸重复基元数目明显不同。
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