【摘 要】
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研究背景:酒精对心脏的影响一直是心脏病学界感兴趣的话题,据世界卫生组织等统计,全球约有2.37亿男性和0.46亿女性因饮酒致病。欧洲国家（特别是俄罗斯）人均酒精年消费量为全球最高,酒精性心肌病致死率也是最高,形势较为严峻。酒精性心肌病（alcoholic cardiomyopathy,ACM）被定义为与长期酗酒（大于80克/天,超过5年以上）有关的获得性扩张型心肌病。探寻ACM的致病机制,寻找AC
【基金项目】
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国家自然科学基金委（N0.81670354/82070387）；
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研究背景:酒精对心脏的影响一直是心脏病学界感兴趣的话题,据世界卫生组织等统计,全球约有2.37亿男性和0.46亿女性因饮酒致病。欧洲国家（特别是俄罗斯）人均酒精年消费量为全球最高,酒精性心肌病致死率也是最高,形势较为严峻。酒精性心肌病（alcoholic cardiomyopathy,ACM）被定义为与长期酗酒（大于80克/天,超过5年以上）有关的获得性扩张型心肌病。探寻ACM的致病机制,寻找ACM可能的治疗靶点,是心脏病学研究的重要问题。线粒体作为心肌细胞中重要的细胞器,为心肌细胞提供90%以上的能量供应,维持机体正常的生命活动。研究发现,线粒体是酒精攻击的主要细胞器之一,长期酒精摄入会导致心脏线粒体结构和功能异常,导致线粒体碎片化。提示线粒体异常分裂可能参与了酒精性心肌病发展过程,但其调控机制还不清楚。本课题拟通过在体动物实验和离体细胞实验探讨线粒体融合分裂在酒精性心肌病中的作用和机制。研究目标:1.阐明酒精性心肌病线粒体融合-分裂的变化;2.观察调节线粒体融合-分裂对酒精性心肌病的影响及机制。研究方法:第一部分:酒精性心肌病发生发展过程中线粒体形态及相关蛋白的变化。8周龄雄性C57小鼠正常流质饮食饲喂2周适应后,随机分为两组:正常流质饮食组和酒精流质饮食组,喂养8周后采用超声心动图评价小鼠心脏功能;摘眼球取血法获得血浆,测定乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）水平;二氢乙锭（Dihydroethidium,DHE）染色检测小鼠心肌氧化应激变化;WGA（Wheat Germ Agglutinin）染色和Masson染色观察小鼠心肌肥厚和纤维化程度;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡;透射电镜观察心肌线粒体形态变化;Western Blotting检测线粒体融合蛋白（Mfn1,Mfn2,Opa1）及分裂蛋白（Drp1,Fis1）以及凋亡蛋白（Casepase3,Bcl2,Bax）的表达。第二部分:酒精性心肌病离体原代细胞模型构建和细胞水平线粒体动力学变化。分离大鼠仔鼠原代心肌细胞,采用乙醇或/和乙醛处理培养,流式细胞术检测心肌细胞凋亡水平,Cellular ROS和Mito-SOX染色分别检测细胞整体和线粒体氧化应激水平;JC-1检测膜电位变化;Mito-Tracker Red观察细胞线粒体的形态学变化;Western Blotting检测线粒体融合、分裂及凋亡蛋白的变化。第三部分:上调Mfn2减轻乙醇乙醛混合处理下的细胞损伤。分离大鼠仔鼠原代心肌细胞,采用乙醇乙醛混合处理培养,腺病毒转染过表达Mfn2,流式细胞术检测心肌细胞凋亡水平,Cellular ROS和Mito-SOX染色检测细胞整体和线粒体氧化应激水平;JC-1检测膜电位变化;Mito-Tracker Red观察细胞线粒体形态学变化。研究结果:1.在整体动物水平,与正常流质饮食小鼠相比,酒精流质饮食饲喂8周后,小鼠左心室射血分数和短轴缩短率明显降低,血浆LDH水平显著提高。心肌氧化应激水平、凋亡水平增加,并出现了心肌肥厚和纤维化。心肌线粒体碎片化增加,线粒体融合蛋白Mfn2表达显著降低,凋亡相关蛋白Caspase 3和Bax表达增加,抗凋亡蛋白Bcl2表达降低。这些结果表明酒精摄入引起心肌损伤和线粒体分裂。2.在离体细胞水平,与正常对照组相比,单独乙醇处理组心肌细胞凋亡没有显著变化,线粒体损伤情况不显著;单独乙醛组或乙醇加乙醛混合处理组细胞凋亡显著增加,细胞和线粒体氧化应激水平都显著增高,线粒体分裂增加,膜电位降低,融合蛋白Mfn2的m RNA和蛋白表达均显著降低。与单独乙醛组相比,乙醇加乙醛混合处理组细胞损伤更为显著,表明离体环境的乙醇加乙醛混合处理更能模拟在体的酒精损伤。3.与空载对照病毒相比,过表达Mfn2的腺病毒能显著降低乙醇加乙醛混合处理下的心肌细胞凋亡,降低细胞和线粒体的氧化应激水平,提高线粒体膜电位,减轻线粒体碎片化程度,促进线粒体融合。研究结论:1.酒精性心肌病线粒体分裂异常增加,线粒体融合蛋白Mfn2表达下调。2.上调Mfn2可抑制乙醇乙醛混合处理下的心肌线粒体分裂,改善线粒体功能,减轻氧化应激水平,减少心肌细胞损伤。
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