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目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是导致中老年人功能残疾、经济负担加重的主要疾病之一。近年来,OA发病率逐年增高,且发病年龄出现了逐步年轻化的趋势,但OA的临床治疗仍局限于对症治疗,如缓解关节疼痛、关节肿胀等症状,严重者只能行关节置换手术,尚无有效的软骨损伤修复方法。软骨组织工程是目前关节软骨损伤修复研究领域的重点之一,可以利用少量的软骨细胞经过体外培养、扩增后,附着在一定的支架材料上移植到体内形成新的有生命力的软骨组织,对软骨损伤进行修复。但研究发现在多次传代培养过程中,软骨细胞逐渐肥大并失去其表型,且增殖能力也会显著降低,不能产生正常的软骨基质,丧失形成软骨的能力。因此在体外扩增软骨细胞过程中有效抑制肥大分化,促进增殖是软骨组织工程亟待解决的关键问题之一。组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）是一种II类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）,主要分布在脑、肌肉和软骨组织中。研究表明HDAC4可通过抑制Runx-2（软骨细胞肥大分化的关键基因）的转录活性,抑制软骨细胞肥大分化,不仅在软骨细胞肥大和骨骼发育过程中起着中心调控作用,在OA发病过程中也发挥了重要作用。值得注意的是,我们前期结果显示:HDAC4不仅具有抑制软骨细胞肥大的功能,还可促进软骨细胞增殖,但只有HDAC4进入细胞核才能有效发挥其功能。Caspase-3可诱导HDAC4降解,14-3-3蛋白可与HDAC4在胞浆中结合,这都是减少软骨细胞核中HDAC4含量的主要原因。因此我们假设,突变Caspase-3降解位点及14-3-3结合位点可增加软骨细胞核中HDAC4含量,进而发挥其抑制软骨细胞肥大促进软骨细胞增殖的功能,达到优化软骨组织工程种子细胞的目的。本研究的主要研究目的:研究突变Caspase-3裂解位点及14-3-3蛋白结合位点的去乙酰化酶4（HDAC4）是否可通过增加软骨细胞核中HDAC4含量,进而增强其抑制软骨细胞肥大,维持软骨细胞正常功能并促进软骨细胞增殖,达到优化软骨组织工程种子细胞（软骨细胞）的作用,同时对其促进软骨细胞增殖的机制进行初步探讨。方法:1.构建RFP-HDAC4-GFP及RFP-AD-S246/467/632A/A289E-HDAC4-GFP腺病毒,并利用已构建的腺病毒及Caspases抑制剂干预离体培养的人膝关节软骨细胞。于转染后48h,Western blot检测法检测各组HDAC4降解情况。2.利用免疫共沉淀法检测各组HDAC4与14-3-3蛋白之间的结合情况。3.将离体培养的软骨细胞分为:空病毒组（Control）,野生型HDAC4（RFP-HDAC4-GFP,WT-HDAC4）转染组WT-HDAC4+Caspase inhibitor组及突变的HDAC4（RFP-AD-S246/467/632A/A289E-HDAC4-GFP,M-HDAC4）转染组。于转染后48h,利用荧光显微镜及western blot法观察各组细胞中HDAC4亚细胞定位情况;4.利用western blot和realtime-PCR检测软骨细胞肥大指标:RUNX相关转录因子2（Runx-2）,十型胶原（Type-X collagen）及基质金属蛋白激酶-13（MMP-13）及软骨细胞功能指标:二型胶原（Type-II collagen）,Sox-9及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）含量,CCK-8法,western blot检测细胞增殖指标PCNA（增殖细胞核抗原）评估软骨细胞增殖情况,观察是否突变的HDAC4可以进入细胞核并抑制软骨细胞肥大,维持软骨细胞正常功能,促进软骨细胞增殖。5.免疫共沉淀法检测Control组、WT-HDAC4组及M-HDAC4组软骨细胞中HDAC4与PCNA结合情况。并利用携带有GFP的不同长度HDAC4片段质粒(1-289,1-326,1-699,629-1040及full-HDAC4干预离体培养的软骨细胞,免疫共沉淀法检测HDAC4与PCNA相互作用位点,初步探讨HDAC4促进软骨细胞增殖的作用机制。结果:1.Western blot结果显示:突变Caspase-3降解位点可有效减少HDAC4降解2.免疫共沉淀结果显示:突变14-3-3蛋白结合位点可有效减少HDAC4组与14-3-3蛋白在胞浆中的结合量。3.荧光显微镜及Western blot结果显示:与WT-HDAC4组相比,转染后48h,M-HDAC4组细胞核中HDAC4含量显著增加（***P<0.001,n=3）。4.Real time–PCR结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞肥大指标Runx-2,Type-Ⅹcollagen及MMP-13显著降低（*P<0.05,n=6）。5.Western blot结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞肥大指标Runx-2（***P<0.001,n=3）,TypeⅩcollagen（*P<0.05,n=3）及MMP-13（**P<0.01,n=3）蛋白水平显著降低。6.Real time–PCR结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞功能指标TypeⅡcollagen,Aggrecan及Sox-9显著增高（*P<0.05,n=6）。7.Western blot结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞功能指标TypeⅡcollagen（***P<0.001,n=3）,Aggrecan（*P<0.05,n=3）及Sox-9（**P<0.01,n=3）显著增高。8.CCK-8细胞增殖检测结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞增殖能力在转染后24h（**P<0.01,n=3）,48h（*P<0.05,n=3）,72h（***P<0.001,n=3）,5d（***P<0.001,n=3）均显著增高。Western blot结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞中PCNA蛋白含量明显增高（**P<0.01,n=3）,9.免疫共沉淀结果显示HDAC4可与PCNA结合,且M-HDAC4组HDAC4蛋白与PCNA结合量更多。10.免疫共沉淀结果显示:软骨细胞中内源性PCNA可与1-669,629-1040及full-HDAC4结合,但不与1-289,1-326 HDAC4片段结合,提示HDAC4与PCNA结合位点不在1-326,可能在326-669之间。结论:1.突变HDAC4 Caspase-3裂解位点及14-3-3结合位点可有效抑制软骨细胞肥大,维持正常软骨细胞功能并促进软骨细胞增殖的作用,达到优化软骨组织工程种子细胞（软骨细胞）的目的。2.HDAC4与PCNA的结合可能与HDAC4促软骨细胞增殖作用有关;HDAC4蛋白326-669之间可能存在一个与PCNA结合的位点。