马铃薯镉转运基因StNRAMP2克隆及功能分析

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马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界第四大粮食作物,土壤重金属污染使马铃薯重质量安全备受关注。研究马铃薯积累重金属的分子机制,对降低重金属在马铃薯可食用部位富集具有重要意义。天然抗性相关巨噬细胞蛋白家族基因(Natural Resistance Associated Macrophage Protein,NRAMP),是一类转运 Cd的膜蛋白,该基因家族在水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)已有大量研究,但在马铃薯中有关NRAMP基因的功能研究鲜有报道。因此,本研究从马铃薯基因组中鉴定出NRAMP家族基因,并进行生物信息学分析和不同重金属胁迫下的基因表达分析,筛选出响应镉胁迫的基因StNRAMP2,以马铃薯耐镉品种‘云薯505’为试验材料,通过病毒诱导的基因沉默技术(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)沉默StNRAMP2基因,并将StNRAMP2在番茄中异源表达,测定植株在重金属胁迫后,StNRAMP2基因相对表达量、重金属含量以及抗氧化酶活性变化等指标,以期为研究马铃薯积累镉的分子机制提供理论依据。主要研究结果如下:(1)从马铃薯基因组中鉴定出5个NRAMP基因,进化分析将NRAMP家族基因划分为4个亚家族,RNAMP家族基因长度为3490~8383 bp,可编码481~1286个氨基酸;分子量为53.33 kDa~139.32 kDa。StNRAMP基因家族成员中含有的顺式作用元件差异较大。StNRAMP3只含有MYB顺式作用元件,StNRAMP1和StNRAMP4含有脱落酸应答元件;StNRAMP5含有较多的植物激素响应元件,包括赤霉素响应元件TATC-box、水杨酸响应元件TCA-element、植物生长素响应元件TGA-box,推测该基因表达受到多种植物激素的共同调控。(2)实时荧光定量PCR分析表明,马铃薯NRAMP基因家族成员在应答不同重金属胁迫时其表达存在差异。StNRAMP1几乎不响应重金属胁迫,与胁迫0 h相比,StNRAMP2显著响应Cd2+胁迫,且在叶组织中胁迫6h表达量达到最高;表明StNRAMP2可能与响应Cd胁迫有关。(3)未沉默StNRAMP2马铃薯植株在100 mg/kg镉胁迫下研究表明,镉含量为根>老叶>成熟茎>幼茎>新叶>块茎;沉默StNRAMP2植株镉含量为根>老叶>成熟茎>幼茎>新叶>块茎,与未沉默StNRAMP2基因植株相比,沉默植株除块茎中镉含量略微增加外,其他组织中镉含量均显著降低,成熟茎中降低了 0.156 mg/kg,降低了 66.30%。在老叶中镉浓度降低了 0.164 mg/kg,降低了 63.48%,表明马铃薯StNRAMP2基因主要参与镉向较老组织中转运,沉默NRAMP2基因有助于降低马铃薯中镉的含量,且促进镉从茎向叶的转运。(4)100 mg/kg镉胁迫下,番茄中超量表达StNRAMP2发现,转基因番茄茎中镉含量较野生型植株无显著差异,根和叶中镉含量均显著高于非转基因植株,其中以根中含量差异最为显著;镉胁迫15 d时,转基因植株镉含量较野生型增加了 3.5倍,而镉胁迫30 d增加了 3倍。在叶中,胁迫15 d增加了 1.5倍,胁迫30 d增加了 1.6倍,过表达StNRAMP2基因可增加番茄根和叶重金属含量,表明StNRAMP2基因功能与镉积累有关。
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