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第一部分 S1PR2在脓毒症巨噬细胞焦亡中的作用研究目的:巨噬细胞焦亡可以导致大量胞内促炎物质的释放,迅速产生强劲的炎症反应风暴,导致组织损伤和脏器功能受损,继而引起脓毒症患者的死亡。S1PR2(Sphingosine-1-phosphatereceptor2,S1PR2)是一种 G 蛋白偶联受体,它是巨噬细胞中表达量最多的S1P(Sphingosine 1-phosphate,S1P)受体成员。S1PR2与配体S1P结合后介导了多种胞内的信号转导,具有广泛的生物学效应。虽然已有研究表明S1PR2可以增加内毒素诱导的脓毒症的炎症反应,但是其在腹腔大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)诱导的脓毒症中对炎症反应的作用及机制尚且不清楚。因此,本部分研究拟通过S1PR2基因敲除、药理学抑制的方法来研究S1PR2对腹腔感染E.coli诱导的脓毒症预后和巨噬细胞焦亡的作用。研究方法:野生型(WT)和S1PR2基因敲除(S1pr2-/-)小鼠腹腔注射大肠杆菌建立脓毒症模型,然后观察小鼠的48h生存率,并在模型后的Oh和6h时间点分别取这两种基因型小鼠的血浆和腹腔灌洗液。采用流式细胞分析术检测腹腔巨噬细胞焦亡的发生情况。采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assays,ELISA)来检测血浆和腹腔灌洗液中的促炎因子IL-1β和TNF-α水平。WT小鼠在腹腔感染E.coli脓毒症模型后给予S1PR2抑制剂,然后观察48h生存率、腹腔巨噬细胞焦亡、IL-1β和TNF-α水平。研究结果:腹腔感染E.coli诱导的脓毒症模型后,S1pr2-/-小鼠48h生存率较WT小鼠明显提高(WT小鼠生存率为20%,S1pr2-/-小鼠生存率为70%,**P<0.01)。在0h时间点时,S1pr2-/-与WT小鼠腹腔巨噬细胞焦亡的产生没有显著差异(P>0.05),血浆和腹腔灌洗液中炎症因子IL-1β和TNF-α水平基本检测不到;而在6h时间点时,S1pr2-/-小鼠腹腔巨噬细胞焦亡较WT小鼠发生显著的降低(WT巨噬细胞焦亡发生率为35%,S1pr2-/-巨噬细胞焦亡发生率为10%,***P<0.001),血浆和腹腔灌洗液中IL-1β水平也明显较WT小鼠低,TNF-α水平无统计学意义的差异。WT小鼠使用S1PR2抑制剂后,与S1PR2基因敲除后结果相同,均可以提高E.coli脓毒症小鼠的生存率,同时降低巨噬细胞焦亡,血浆和腹腔灌洗液中IL-1β水平。研究结论:S1PR2缺失可以减少巨噬细胞焦亡的发生,改善腹腔E.coli感染诱导的脓毒症的预后。第二部分 S1PR2调节脓毒症巨噬细胞焦亡的机制研究研究目的:细胞焦亡的产生必须依赖胞内炎性体的活化。虽然炎性体种类较多,但每种炎性体的激活物是相对特异的。在E.coli诱导的脓毒症中,主要激活NLRP3经典炎性体和caspase-11介导的非经典炎性体。第一部分的研究结果显示,S1PR2缺失可以减轻巨噬细胞焦亡的发生,从而改善脓毒症的预后。因此,本部分将通过体外培养腹腔巨噬细胞来探究S1PR2调节脓毒症巨噬细胞焦亡的作用机制。研究方法:分别提取WT和S1pr2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞进行体外培养,E.coli刺激后,采用上清乳酸脱氢酶(LDH)来检测巨噬细胞焦亡情况,采用ELISA来检测细胞上清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平。WT小鼠腹腔巨噬细胞转染S1PR2过表达腺病毒48h后,通过检测S1PR2蛋白水平来观察转染效果;并且检测S1PR2过表达对E.coli刺激引起的巨噬细胞焦亡和IL-1β、TNF-α水平的影响。S1PR2基因敲除或过表达后采用Western blots检测E.coli刺激导致的caspase-11非经典炎性体的活化水平。体外检测S1PR2抑制剂对E.coli刺激的WT和Nlrp3-/-小鼠腹腔巨噬细胞焦亡和caspase-11活化的作用。采用pulldown技术检测S1PR2基因敲除或过表达后E.coli刺激的腹腔巨噬细胞中RhoA-GTP水平。WT和S1PR2过表达的WT腹腔巨噬细胞分别用E.coli刺激后,检测RhoA抑制剂后处理对caspase-11活化水平的作用。研究结果:E.coli刺激WT和S1pr2-/-小鼠腹腔巨噬细胞16h后,S1pr2-/-产组细胞焦亡的发生明显低于WT组(*P<0.05)。细胞培养上清中S1pr2-/-组较WT组IL-1β水平明显降低,而TNF-α水平无显著改变。WT小鼠腹腔巨噬细胞中,S1PR2过表达组S1PR2蛋白水平较对照组明显提高;同时E.coli刺激后细胞焦亡的发生和细胞培养上清中IL-1β水平也明显增加,而TNF-α水平没有统计学差异。S1PR2基因敲除或过表达后采用Western blots检测E.coli刺激导致的caspase-11非经典炎性体的活化水平,发现S1PR2基因敲除明显减弱了 caspase-11活化水平(*P<0.05),S1PR2过表达明显增加了 caspase-11活化水平(*P<0.05)。E.coli刺激的Nlrp3-/-小鼠腹腔巨噬细胞与WT小鼠腹腔巨噬细胞相比,细胞焦亡的产生并没有减少。不仅如此,而且E.coli刺激的Nlrp3-/-小鼠腹腔巨噬细胞给予S1PR2抑制剂预处理,与WT小鼠腹腔巨噬细胞中结果相似,S1PR2抑制剂组较溶剂对照组细胞焦亡水平显著降低。同样的,NLRP3缺失并没有影响S1PR2对caspase-11的激活作用。E.coli刺激16h后的Pull down结果显示,S1pr2-/-腹腔巨噬细胞中RhoA-GTP水平较WT腹腔巨噬细胞明显降低;与此相反,S1PR2过表达明显增加了 RhoA-GTP水平。使用RhoA抑制剂后处理,不仅降低了 WT腹腔巨噬细胞中E.coli诱导的caspase-11活化水平;而且可以逆转S1PR2过表达对caspase-11活化的上调作用。研究结论:S1PR2促进巨噬细胞焦亡的产生是caspase-11依赖的,其中RhoA参与了S1PR2对caspase-11的激活作用。第三部分 革兰氏阴性菌脓毒症患者单核细胞中caspase-4与S1PR2表达的相关性分析研究目的:第一部分和第二部分的研究结果证明,S1PR2通过激活caspase-11依赖的非经典炎性体加重E.coli脓毒症的预后。已有研究报道S1PR2与脓毒症的不良预后具有一定的相关性,为了进一步研究caspase-11在脓毒症中的临床意义,本部分将探究革兰氏阴性菌脓毒症患者单核细胞中caspase-4(小鼠caspase-11在人类中的同源物)和S1PR2的表达情况,并分析其相关性。研究方法:根据sepsis-3的标准收集2016年9月-2017年1月期间,入住ICU 24h内的革兰氏阴性菌脓毒症患者和非脓毒症患者的外周血标本。排除18岁以下,患有肿瘤、HIV、病毒性肝炎,怀孕和进行免疫抑制剂治疗的患者。同时,记录患者的基本特征,包括 APACHE Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ)评分和SOFA(SequentialOrganFailureAssessment)评分,感染部位及感染的微生物种类等。采用Ficoll密度梯度离心贴壁法来分离外周血单核细胞,然后采用定量PCR的方法检测S1PR2和caspase-4的表达水平,进行相关性统计分析。研究结果:本研究共纳入了 11例革兰氏阴性菌脓毒症患者和8例非脓毒症患者。其中,72.7%的脓毒症患者为腹腔感染,82%的脓毒症患者为大肠杆菌感染。在脓毒症患者的单核细胞中caspase-4和S1PR2的表达水平较对照组均有显著的增加(*P<0.05)。而且,两者表达水平的相关性研究发现,两者具有正相关作用(r=0.636;*P<0.05)。研究结论:革兰氏阴性菌脓毒症患者的单核细胞中caspase-4表达增加,并且与S1PR2的表达呈现正相关。Caspase-4和S1PR2可能是潜在的革兰氏阴性菌脓毒症治疗的新靶标。