心肌缺血是危害人类健康的主要疾病之一,由其导致的心肌梗死更是引起患者死亡的重要原因。心肌缺血可致氧自由基大量增加,氧化应激又可进一步加重心肌缺血性损伤;而心肌梗死后的心室重塑及纤维化更是导致心功能下降的主要病理基础。心肌细胞肥大、炎症和纤维化被认为是心肌梗死后组织进行代偿修复最主要病理特征,这种特征又可导致心功能的进一步下降,从而引发恶性循环。因此,寻找安全有效的防治心肌缺血损伤及阻止缺血后心室重塑和纤维化的药物具有重要意义。大蒜辣素是国际公认的大蒜主要活性物质,国内一直将大蒜素作为大蒜的主要活性成分,因此对大蒜辣素的研究较少。大蒜辣素是一种具有多种生物活性的药物,许多研究证实其具有抑制细胞凋亡、抗炎、抗氧化等作用。本研究主要研究大蒜辣素对急性心肌缺血的即刻保护作用及长期应用对梗死后心室重塑和心肌纤维化的防治作用,在此基础上进一步研究了大蒜辣素对心肌成纤维细胞功能及其电生理的影响,为大蒜辣素应用于临床提供实验依据。目的1.明确大蒜辣素对急性心肌缺血大鼠的心肌保护作用及对缺血后氧化应激的对抗作用。2.研究大蒜辣素长期应用对大鼠心肌缺血后心室重塑和心功能的影响,并明确其对梗死后心肌纤维化的干预作用及其与TGFβ/Smads信号通路的关系。3.阐明大蒜辣素对大鼠心肌成纤维细胞增殖分化及胶原分泌的的影响,并进一步明确大蒜辣素对心肌成纤维细胞中电导钙激活钾通道(KCa3.1)电流及通道的影响。方法1.大蒜辣素对急性心肌梗死大鼠的心肌保护作用70只wistar大鼠随机分为七组:空白对照组、假手术组、模型组、地尔硫组(1.5mg/kg)、大蒜辣素低(1.2mg/kg)、中(1.8mg/kg)、高(3.6mg/kg)剂量组。除空白组和假手术组外,其余各组大鼠均采用冠状动脉结扎方法复制大鼠心肌缺血模型,术后即刻尾静脉注射相应药物,24h后处死大鼠,取心脏及血清检测以下指标:血清肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、肌红蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及氧化应激指标SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平;NBT染色检测心肌梗死范围。2.大蒜辣素对大鼠心肌梗死后心室重塑和心肌纤维化防治作用Wistar大鼠60只,随机分为六组:假手术组、模型组、地尔硫(1.5mg/kg)组和大蒜辣素低剂量组(1.2mg/kg)、中剂量组(1.8mg/kg)、高剂量组(3.6mg/kg)。除假手术组外,其余各组冠状动脉结扎法复制大鼠心肌缺血模型,假手术组只穿线不结扎。模型制作成功后第二天各组开始腹腔注射相应药物,连续给药21天。21天后,小动物超声检测大鼠心脏结构及功能的变化;Masson染色观察心脏纤维组织变化;免疫组化检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGFβ1/Smads信号途径相关蛋白TGFβ1、Smad3和Smad7的表达表达情况。3.大蒜辣素对大鼠心肌成纤维细胞的作用及机制采用差速贴壁法体外分离培养乳鼠心肌成纤维细胞,将细胞分为正常对照组、AngⅡ组,大蒜辣素低(0.2μM)、中(1μM)、高(5μM)剂量组。除正常对照组外,其余组利用AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖分化,大蒜辣素各剂量组同时给予大蒜辣素干预。24h后检测以下指标:倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化;MTS检测各组细胞增殖情况;免疫荧光染色检测细胞内α-SMA表达以确定其分化;qRT-PCR和Western blot检测成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白表达;膜片钳技术记录心肌成纤维细胞Kca3.1电流密度,并应用qRT-PCR和Western blot确定大蒜辣素对KCa3.1mRNA和蛋白表达的影响;在此基础上利用H2S合成酶抑制剂PAG进一步确定H2S信号途径与大蒜辣素作用的关系。结果1.大蒜辣素对急性心肌梗死大鼠的心肌保护作用(1)心肌梗死范围和血清标志物与模型组比较,地尔硫及大蒜辣素低、中、高剂量均显著降低心肌梗死大鼠模型的心肌梗死范围(P<0.01);模型组大鼠血清cTn-Ⅰ水平较假手术组和空白组显著升高(P＜0.01),地尔硫组、大蒜辣素中、高剂量组血清cTn-Ⅰ水平较模型组显著降低(P<0.05),但大蒜辣素低剂量组血清cTn-Ⅰ水平与模型组比较差异无显著性(P>0.05);与模型组比较,各药物治疗组血清CK-MB和Mb水平均有降低趋势,但各组CK-MB水平差异无显著性,只有大蒜辣素高剂量组血清Mb水平与模型组比较差异有显著性(P<0.05)。(2)氧化应激指标模型组大鼠SOD和GSH-Px较空白对照组和假手术组均有降低趋势,而地尔硫组和大蒜辣素低、中、高剂量组血清SOD和GSH-Px水平较模型组也有升高趋势,但各组间差异均不显著(P>0.05);模型组CAT水平较假手术组显著升高(P<0.01),地尔硫草组和大蒜辣素各剂量组与模型组比较显著降低(P<0.05);而对于血清MDA水平,模型大鼠血清MDA较假手术组明显增高(P<0.05),应用地尔硫和大蒜辣素治疗后,血清MDA水平均有降低趋势,但只有大蒜辣素中、高剂量组与模型组比较差异具有显著性(P<0.05)。2.大蒜辣素对大鼠心肌梗死后心室重塑和心肌纤维化防治作用(1)大鼠超声心动图结果大蒜辣素各剂量组左室前壁厚度(LVAWd/s)均较模型组显著增加(P ＜0.05)。而左室后壁厚度(LVPWd/s)各组之间无显著差异(P>0.05)。同时,大蒜辣素各剂量组还可减小收缩期左室内径(LVIDd/s)。通过对射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)、每搏输出量(SV)计算结果显示,大蒜辣素可明显改善心功能,EF、FS和SV水平较模型组显著增高(P<0.05)。(2)心肌Masson染色及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达结果Masson染色显示,模型组大鼠心脏纤维组织显著增多,而各药物治疗组心脏纤维组织减少;免疫组化结果显示:模型组大鼠心肌纤维化明显,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量较假手术组显著增加(P<0.05),大蒜辣素各剂量组均可抑制心肌纤维化发展,显著减少Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达(P<0.05)。(3)TGFβ/mads通路信号蛋白表达变化与正常组比较,模型组大鼠心肌中TGF-β1、Smad3表达显著增加(P＜0.05),Smad7表达显著减少(P<0.05)。与模型组比较,大蒜辣素中、高剂量组显著抑制大鼠非梗死区心肌中TGF-β1和Smad3的表达(P＜0.05),而Smad7的表达增加(P<0.05),大蒜辣素低剂量组与模型组比较差异无显著性(P>0.05)。3.大蒜辣素对大鼠心肌成纤维细胞的作用及机制(1)对心肌成纤维细胞增殖分化的影响在细胞形态学水平,细胞贴壁生长,为星形扁平细胞,无自发性搏动。24h后正常对照组细胞较稀少,经AngⅡ刺激后,细胞数量增多,大蒜辣素各剂量组细胞数量较AngⅡ组明显较少;MTS结果显示,与正常组心肌成纤维细胞比较,AngⅡ组细胞活力显著增高,而大蒜辣素高、中、低剂量干预24h后细胞活力较AngⅡ组细胞活力显著降低(P<0.01);免疫荧光染色结果显示,AngⅡ作用24h后,心肌成纤维细胞α-SMA表达较正常组明显增强,而给予大蒜辣素干预后,α-SMA表达量较AngⅡ组明显降低。提示大蒜辣素可抑制心肌成纤维细胞增殖分化。(2)心肌成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达变化qRT-PCR与Western blot结果显示,AngⅡ刺激后,成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达量较正常对照组明显升高(P<0.05)。与AngⅡ组比较,大蒜辣素高剂量组和大蒜辣素中剂量组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达量显著降低,差异有显著性(P＜0.01),但大蒜辣素低剂量组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达量与AngⅡ组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)大蒜辣素对心肌成纤维细胞KCa3.1的影响①首先应用膜片钳记录了大蒜辣素对全细胞钾电流的影响,结果显示,AngⅡ组细胞全细胞钾电流的电流密度显著升高,而大蒜辣素高剂量组可显著抑制全细胞钾电流的电流密度,低剂量组和中剂量组电流密度与AngⅡ组比较无显著差异;应用电流密度绘制钾通道的激活曲线,显示大蒜辣素对钾离子通道的激活性质并无影响。②KCa3.1在心肌成纤维细胞的增殖和分化过程中发挥了重要作用,为证明大蒜辣素所影响的钾电流是否有KCa3.1,在记录全细胞钾电流后急性加入KCa3.1特异性阻断剂TRAM-34进行观察,所记录到的电流即为TRAM-34不敏感钾电流。用全细胞钾电流减去TRAM-34不敏感钾电流得到TRAM-34敏感钾电流,即为KCa3.1电流。与正常组比较,AngⅡ可显著升高大鼠心肌成纤维细胞KCa3.1的钾离子电流密度,应用大蒜辣素干预后,大蒜辣素高剂量组电流密度较AngⅡ组显著降低(P<0.05)。绘制各组细胞KCa3.1的激活曲线显示大蒜辣素对KCa3.1离子通道的激活性质无显著影响,说明大蒜辣素抑制KCa3.1钾电流并非通过影响离子通道的激活性质实现,可能通过其他机制影响KCa3.1。(4)心肌成纤维细胞KCa3.1 mRNA及蛋白表达变化为确定大蒜辣素影响KCa3.1的机制,应用qRT-PCR和Western blot检测了KCa3.1 mRNA及蛋白表达水平变化。结果显示,AngⅡ可显著上调心脏成纤维细胞KCa3.1离子通道mRNA和蛋白表达(P<0.01),而大蒜辣素各剂量组成纤维细胞KCa3.1离子通道mRNA和蛋白表达较AngⅡ组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)大蒜辣素下调KCa3.1作用与H2S信号通路的关系H2S是具有心脏保护及抗纤维化作用的信号分子,大蒜辣素可作为H2S供体发挥心肌保护作用。通过应用H2S合成酶抑制剂PAG发现,PAG可显著抑制大蒜辣素对KCa3.1 mRNA和蛋白表达的调节作用。加入PAG后,大蒜辣素下调KCa3.1表达的作用被取消,与大蒜辣素组比较差异有显著性(P<0.05),说明大蒜辣素对KCa3.1的调节作用与H2S信号通路有关。结论1.大蒜辣素在大鼠心肌梗死造模后即刻给药能对缺血心肌产生保护作用,可明显减小心肌梗死范围、降低血清心肌梗死标志物水平并改善氧化应激指标。2.大蒜辣素在心肌梗死造模后长期给药可抑制心室重塑、改善心功能,同时也可抑制心肌纤维化的发展,其机制与调节TGFβ/Smads信号通路有关。3.大蒜辣素在细胞水平可抑制心肌成纤维细胞增殖分化,减少心肌成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。4.大蒜辣素还可抑制心肌成纤维细胞Kca3.1电流密度,这一作用与影响KCa3.1的激活性质无关,而是通过下调细胞KCa3.1通道表达而实现。大蒜辣素对KCa3.1通道的调节作用与H2S信号途径有关。