论文部分内容阅读
大豆根部病害是造成我国大豆生产中产量损失的主要因素。引起大豆根部病害的病原真菌及卵菌多达十几种。引起的病害症状往往相似,不易区别,给病害准确诊断带来困难。本文基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,建立了大豆根部8种主要病害的LAMP检测技术体系,可以从发病组织提取的DNA中特异性的检测出目标病原菌,从而快速诊断病害,对及时指导病害防治有意义。在上述基础上,本文通过对LAMP检测技术操作程序及实验条件进行改进,建立了可在田间进行病害诊断的技术体系。进而,将LAMP技术与9%孔板相结合,集成了本文建立的8个LAMP检测体系以及本实验室前期建立的检测大豆疫霉的LAMP体系,建立了可同时诊断9种大豆根部病害的高通量检测技术体系。本研究结果对提升我国植物病害诊断技术水平有重要价值。第一章的研究建立了针对大豆镰孢根腐病的快速诊断技术。大豆镰孢根腐病是由多种镰孢菌引起的以导致根部和茎基部腐烂为主要症状的病害的通称。本研究逐一建立了5个直接从侵染大豆植株上检测5种镰孢菌进行诊断大豆镰孢根腐病的LAMP检测技术体系,分别是CYP51C-Fo-LAMP,CYP51C-Fe-LAMP,CYP51C-Fg-LAMP,TEF-1α-Fs-LAMP和TEF-1α-Fp-LAMP检测技术体系,可以分别特异性检测引起大立镰孢根腐病的尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、茄腐镰孢菌(F.solani)、层出镰孢菌(F.proliferatum)。这5个LAMP技术体系都可以从田间发病的大豆植株中直接对病原菌进行检测,反应条件都为62℃,65分钟,反应结束后在反应管内加入SYBR GreenⅠ可对结果进行直接的判定,阳性结果呈黄绿色并且在紫外灯下有强烈的荧光,阴性反应则仍然为橙色且没有荧光。应用上述这5个检测技术体系,我们成功且快速地对江苏、安徽、湖北和云南采集的发病大豆样本进行了病害诊断。第二章的研究建立了针对大豆苗期的大豆立枯病和大豆炭腐病的快速诊断技术。立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的大豆立枯病与菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)引起的大豆炭腐病都是大豆常见的苗期病害,本研究应用LAMP技术,建立了直接从被侵染大豆植株上检测病原真菌进行病害诊断的方法。以内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)基因作为检测这两种真菌的靶标基因,我们分别针对立枯丝核菌和菜豆壳球孢菌设计了ITS-Rs-LAMP技术和ITS-Mp-LAMP技术,这两个技术都可以从田间发病的大豆植株中进行直接对病原菌进行检测。这两种技术的反应条件都为62℃,65分钟。反应结束后在反应管内加入SYBR GreenⅠ可对结果进行直接的判定,阳性结果呈黄绿色并且在紫外灯下有强烈的荧光,阴性反应则仍然为橙色且没有荧光。ITS-Rs-LAMP技术的灵敏度达到10 pg/μL,ITS-Mp-LAMP技术的灵敏度也能达到100 pg/μL。应用上述这两项技术,我们成功且快速地对江苏和安徽采集的发病大豆样本进行了病害诊断。冬青丽赤壳菌(Calonectria ilicircola)引起的大豆红冠腐病(red crown rot ofsoybean)是一种为害大豆的重要病害。该病在发病后期通过症状比较容易识别,大豆叶片变黄萎蔫,植株枯萎,根系腐烂变黑,茎基部及根系表面产生大量红色子囊壳。但是病症出现之前的发病初期及中期,其症状与镰孢菌引起的根腐病相似,不易辨别。本研究应用LAMP技术,建立了直接从发病大豆植株上检测冬青丽赤壳菌,从而诊断大豆红冠腐病的方法。以β-微管蛋白基因作为检测的分子靶标,建立了特异性针对该病原菌的TUB-Ci-LAMP检测技术,62℃反应65 min,扩增结束后加入SYBR GreenⅠ作为指示剂即可观测结果。灵敏度达到10 pg/μL。为了使诊断技术更加简便易行,使之适用于在田间操作,以上述研发的TUB-Ci-LAMP检测技术为基础。针对病组织DNA提取,LAMP检测技术操作以及实验仪器进行了改进,建立了不须依赖离心机的病组织DNA一步法提取技术,使用保温杯替代PCR仪或者恒温水浴锅提供LAMP反应所需的恒温(近恒温)条件使DNA扩增不须依赖电源,将LAMP反应试剂提前混合简化操作过程,最终研发出一套不依赖实验室条件,可以在田间直接进行检测操作的LAMP诊断技术体系。应用LAMP技术结合96孔平板建立了一种针对9种引起大豆根部病害的病原菌,同时检测3个大豆根部病害样本的高通量检测技术。本研究集成了CYP51C-Fo-LAMP,CYP51C-Fe-LAMP,CYP51C-Fg-LAMP,TEF-1α-Fs-LAMP,TEF-1α-Fp-LAMP,A3apro-Ps-LAMP,ITS-Rs-LAMP,ITS-Mp-LAMP,TUB-Ci-LAMP共9个LAMP检测体系,可以分别特异性检测引起大豆根部病害的尖镰孢菌、木贼镰孢菌、禾谷镰孢菌、茄腐镰孢菌、层出镰孢菌、大豆疫霉菌、立枯丝核菌、菜豆壳球孢菌和冬青丽赤壳菌。本研究建立的基于LAMP技术同时检测引起大豆根部病害的9种重要病原菌的高通量分子检测体系,完成一次高通量检测仅需2-3个小时,适合基层单位的实验室和检验检疫机构开展分子检测和病害诊断。