研究背景自发性脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）仍然是一种常见的神经系统急症,在全球范围内发病率和死亡率都很高。流行病学调查发现,非创伤性ICH占所有卒中的10-15%,全世界每年报告的病例超过500万例,其中死亡病例超过300万例。只有12%-39%的患者在ICH后能独立生活,而病死率从7天的35%到1年的60%不等。超过60%以上的幸存者会留下严重的残疾,给社会和家庭带来沉重的负担。血压管理、凝血障碍逆转、颅内压控制、预防血肿扩大和微创血肿清除是目前急性脑出血治疗的主要手段。但是,这些治疗措施的效果有限,并不能显着改善患者的预后。因此,迫切需要更有效的治疗方法来降低ICH患者的致残率和死亡率。最近的研究表明,神经炎症在ICH引起的继发性脑损伤中起着至关重要的作用。红细胞（Red blood cell,RBC）溶解的成分,如铁和血红蛋白,会导致神经炎症,这与ICH患者预后不良密切相关。神经炎症的病理机制包括胶质细胞的激活和极化、中性粒细胞浸润和促炎细胞因子的产生,这些改变能最终导致血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）破坏、脑水肿、神经元死亡和神经功能缺损。靶向ICH后神经炎症的治疗策略可以有效缓解ICH后的继发性脑损伤,这已成为最近脑出血研究中的热点。早在ICH后的第一天就能观察到血肿中的溶血现象。过氧还蛋白-2（Peroxiredoxin-2,PRX-2）作为抗氧化酶过氧还蛋白家族的成员,是红细胞中第三丰富的蛋白质。细胞内PRX-2在各种细胞类型（如红细胞、神经元和中性粒细胞）的抗氧化过程中起重要作用。最近的研究表明,死亡脑细胞释放的细胞外PRX-2可以作为损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns,DAMPs）之一,通过诱导各种促炎因子、激活小胶质细胞/巨噬细胞和促进神经元凋亡介导脑损伤。然而,尚未阐明ICH后细胞外PRX-2的具体作用。Lipocalin-2（LCN-2）是一种由脑星形胶质细胞和中性粒细胞在炎症刺激下分泌的急性期蛋白。越来越多的证据表明,ICH后LCN-2蛋白的表达迅速上调,并在神经炎症中发挥关键作用。LCN-2可直接损伤神经元、激活和极化神经胶质细胞、破坏血脑屏障、诱发脑水肿、介导炎症细胞浸润和促进炎性细胞因子的分泌,并最终导致长期的神经功能缺损。值得注意的是,LCN-2敲除的小鼠在发生脑缺血后,其梗死体积、神经功能缺损、免疫浸润和促炎分子（IL-1β、TNF-α、CCL-2、CXCL-1、CXCL-10、ICAM-1）的表达明显下降。我们之前的研究表明,ICH后LCN-2和PRX-2的表达均上调。然而,LCN-2和PRX-2之间的关系和相互作用的机制仍然未知。因此,本研究探讨了 ICH后PRX-2的潜在作用以及LCN-2在PRX-2诱导继发性脑损伤中的作用机制。方法第一部分本研究探讨了 PRX-2在诱导大鼠脑损伤中的潜在作用,本研究分为四个部分。实验1:Sprague-Dawley（SD）成年雄性大鼠右侧基底节区注射裂解的红细胞或生理盐水（15μl）,并在手术1小时后处以安乐死以进行蛋白质印迹分析。实验2:SD成年雄性大鼠右侧基底节区注射重组大鼠PRX-2、灭活重组大鼠PRX-2（-）或生理盐水（15ul）。所有大鼠在建模24小时后进行MRI和行为学检查。然后将大鼠安乐死以进行脑组织学或蛋白质印迹分析。实验3:SD成年雄性大鼠右侧基底节区注射重组大鼠PRX-2或生理盐水（15μl）。所有大鼠在建模后24和72小时分别进行MRI和行为学检查。然后将大鼠安乐死以进行脑组织学分析。实验4:SD成年雄性大鼠右侧基底节区注射红细胞裂解液和DMSO或conoidin A（15μl）。所有大鼠在建模24小时后进行了 MRI和行为学检查。然后将大鼠安乐死以进行脑组织学分析。第二部分本研究探讨了 LCN-2在PRX-2诱导的神经炎症和脑损伤中的作用机制,本研究分为四个部分。实验1:雄性C57BL/6 WT小鼠右侧基底节区注射生理盐水（10μl）作为对照组,WT、LCN-2KO和HET小鼠右侧基底节区注射PRX-2（10μl）作为实验组。建模24小时后进行MRI成像和行为学检查。然后将小鼠实施安乐死进行脑组织学和蛋白质印迹分析。实验2:雄性WT、LCN-2 KO和HET小鼠右侧基底节区注射PRX-2（10μl）。小鼠在在建模后第1、3、7和14天进行行为学检查,并在第14天完成MRI检查后实施安乐死,脑组织用于组织学分析。实验3:雄性LCN-2 KO小鼠右侧基底节区注射10μl PRX-2和1μg重组小鼠LCN-2蛋白或DMSO。雄性WT小鼠右侧基底节区注射10μl PRX-2和1μg DMSO。在建模24小时后进行MRI和行为学检查,实施安乐死,脑组织用于组织学分析。实验3:雌性LCN-2 KO、LCN-2 HET和WT小鼠右侧基底节区注射PRX-2（10μl）。在建模24小时后进行MRI和行为学检查,对LCN-2 KO、LCN-2 HET和WT组中的6只小鼠实施安乐死,脑组织用于组织学分析。每组中剩余的8只小鼠在第1、3、7和14天进行行为学检查,并在第14天完成MRI检查后实施安乐死,脑组织用于组织学分析。结果第一部分本项研究中没有老鼠死亡。由于脑灌注不良,来自PRX-2组和来自裂解的RBCs+conoidin A组的两只大鼠被剔除。然而,本研究仍使用这两只大鼠的MRI和行为学结果。注射红细胞裂解液1小时后脑基底节区PRX-2水平明显增加。基底节区注射PRX-2 24小时后,血脑屏障破坏、脑肿胀、中性粒细胞浸润、小胶质细胞激活、神经元死亡和神经功能缺损明显增加。而使用PRX-2抑制剂conoidin A后,能明显减轻由裂解红细胞介导的脑肿胀、中性粒细胞浸润、神经元死亡和神经功能缺损。第二部分一只雄性WT小鼠在注射PRX-2后第7天死亡,因此被排除在本研究之外。基底节区注射PRX-2 24小时后,LCN-2的表达明显增高。免疫荧光提示LCN-2阳性细胞主要是中性粒细胞、星形胶质细胞和血管内皮细胞,只有少数LCN-2阳性细胞为小胶质细胞/巨噬细胞和神经元。基底节区注射PRX-2后,与WT组相比,LCN-2 KO和HET雄性小鼠的脑肿胀、神经元死亡、小胶质细胞/巨噬细胞激活、中性粒细胞浸润、脑萎缩和神经功能缺损明显减少。与注射PRX-2+DMSO相比,LCN-2 KO雄性小鼠基底节区注射PRX-2+LCN-2后脑肿胀、神经元死亡、中性粒细胞浸润和神经功能缺损明显加重。与雌性WT小鼠相比,基底节区注射PRX-2后,LCN-2 KO雌性小鼠的脑肿胀、神经元死亡、中性粒细胞浸润和神经功能缺损明显减轻。结论第一部分这些结果表明,血肿释放到细胞外的PRX-2可导致脑出血后的继发性脑损伤（血脑屏障破坏、脑肿胀、中性粒细胞浸润、小胶质细胞/巨噬细胞激活、神经元死亡和神经功能缺损）,并可能成为潜在的治疗靶点。第二部分脑内注射PRX-2能上调LCN-2的表达,并且LCN-2在PRX-2介导的神经炎症（中性粒细胞浸润、小胶质细胞/巨噬细胞激活）和中脑损伤发挥至关重要的作用。图16幅,表7个,参考文献369篇