研究背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是当今威胁人类健康的重要疾病之一。经皮冠状动脉介入治疗是目前治疗冠心病的重要手段,但是较高的术后再狭窄的发生率(15～20%),成为急需解决的临床问题。大量基础研究发现血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移、增殖和细胞外基质的分泌是动脉粥样硬化斑块形成和再狭窄发生的重要环节。因此,要预防冠心病的发生、减少介入治疗术后再狭窄的发生率,发掘能抑制靶部位平滑肌细胞增生的新药物并阐明其作用机制非常重要。迄今为止,诸多研究均提示白藜三醇是一种具有心血管保护作用的多酚类化合物。其中一个重要的机制是白藜三醇可通过抑制血管平滑肌细胞的增殖来减少血管再狭窄的形成。根据白藜三醇的化学结构特点,有学者设计了白藜三醇亲和层析柱,并应用该装置分离、纯化了白藜三醇结合蛋白(RTP)。该蛋白经放射配基自显影法证实可与白藜三醇特异性结合,而用质谱分析该蛋白的氨基酸序列则证实其与醌氧化还原酶2(NQO2)有80%的同源性。白藜三醇是否直接作用于RTP而产生抑制平滑肌细胞增殖和血管内膜增生的保护作用?RTP又是如何调控血管平滑肌细胞增殖的?这些问题目前都还没有答案,需要我们去探索研究。目的:本课题拟研究以下问题:(1)分离、纯化血管平滑肌组织中的RTP,观察RTP和NQO2的关系;(2)白藜三醇对实验性动脉粥样硬化再狭窄形成的影响及对血管壁RTP表达的调控;(3)白藜三醇对血管平滑肌细胞增殖的影响及对胞浆内RTP表达的调控;(4)RTP高表达和低表达对血管平滑肌细胞增殖的调控。通过上述研究,从在体、细胞和分子三个层面来探讨白藜三醇对RTP表达的影响及RTP对血管平滑肌细胞增殖的调控机制,为今后白藜三醇作为冠心病血管再狭窄新的靶向治疗提供理论和实验依据。方法:1.制备白藜三醇亲和层析柱,并从兔主动脉平滑肌组织中分离、纯化RTP,采用蛋白质电泳及western blot进行鉴定;2.雄性新西兰大白兔48只,随机分为3组,分别按以下条件喂养:(1)普通颗粒状兔饲料,(2)高胆固醇饲料,(3)高胆固醇饲料+白藜三醇。喂养12周后,部分实验动物行右侧髂动脉球囊损伤制备再狭窄模型。继续喂养4周后,处死所有实验动物,进行以下检查:(1)血管再狭窄检查:双侧髂动脉对应部位切片、H-E染色,用Leica Qwin显微图像分析软件测量狭窄率和内膜中膜面积比;(2)用Real-time PCR检测双侧髂动脉壁RTPmRNA表达水平的改变;(3)用western blot检测双侧髂动脉壁RTP蛋白表达水平的改变。3.培养兔血管平滑肌细胞并用不同浓度(1、10和50μmol/L)白藜三醇干预不同时间(24、48和72小时),进行以下检查:(1)用细胞计数方法观察白藜三醇对平滑肌细胞增殖的影响;(2)用Real-time PCR检测白藜三醇对血管平滑肌细胞中RTP mRNA表达水平的影响;(3)用western blot检测白藜三醇对血管平滑肌细胞中RTP蛋白表达水平的影响。4.构建RTP的真核表达载体并转染大鼠血管平滑肌细胞,进行以下检测:(1)用半定量RT-PCR和western blot检测转染后平滑肌细胞中RTP的表达;(2)用BrdU细胞增殖检测试剂盒检测转染后平滑肌细胞增殖能力的改变。5.构建RTP的RNA干扰慢病毒载体并转染大鼠血管平滑肌细胞,进行以下检测:(1)用real-time PCR和western blot检测转染后平滑肌细胞中RTP的表达;(2)用BrdU细胞增殖检测试剂盒检测转染后平滑肌细胞增殖能力的改变。结果:1.利用白藜三醇亲和层析柱可从兔血管平滑肌组织中分离、纯化一个分子量约为26kD的蛋白质,将其命名为RTP-26。该蛋白质的分子量与文献记载的NQO2分子量一致,并且在用RTP多克隆抗体,即NQO2抗体进行western blot时可以检测到该蛋白。2.在体实验结果显示白藜三醇能够抑制动脉粥样硬化再狭窄的形成。对照组、动脉粥样硬化模型组和白藜三醇治疗组的血管狭窄率分别为:63.04±3.33%,73.92±7.10%和28.10±5.83%(三组间ANOVA检验,P＜0.01)。髂动脉壁RTP-26的mRNA和蛋白表达水平:白藜三醇明显抑制了RTP-26的表达,mRNA表达较对照组降低了39%,较模型组降低了44%(三组间ANOVA检验,P＜0.01);蛋白表达较对照组降低了35%,较模型组降低了32%(三组间ANOVA检验,P＜0.01)。3.在细胞水平的研究发现:(1)白藜三醇能够抑制血管平滑肌细胞的增殖,且具有浓度依赖和时间依赖的特点。(2)白藜三醇抑制平滑肌细胞内的RTP-26 mRNA表达。1、10和50μmol/L白藜三醇干预平滑肌细胞72小时,细胞内RTP-26 mRNA的表达分别降低了56%、62%和95%,与对照组相比有统计学差异(P＜0.01)。50μmol/L白藜三醇干预平滑肌细胞的时间达到48和72小时时,细胞内RTP-26 mRNA的表达分别降低了53%和95%,与对照组比较有统计学差异(P＜0.01)。(3)RTP-26蛋白的表达也明显降低。10和50μmol/L白藜三醇干预平滑肌细胞72小时,细胞内RTP-26蛋白的表达降低15%和47%,与对照组相比也有统计学差异(P＜0.05和P＜0.01)。50μmol/L白藜三醇干预平滑肌细胞48和72小时,细胞内RTP-26蛋白的表达降低36%和58%,与对照组比较有统计学差异(P＜0.01)。所以,白藜三醇对血管平滑肌细胞中RTP-26 mRNA和蛋白的抑制作用也呈浓度依赖和时间依赖的特点。4.RTP-26高表达载体pEGFP-N1-NQO2成功构建并转染大鼠血管平滑肌细胞,48小时后细胞内RTP-26 mRNA的表达升高1倍,且表达由绿色荧光蛋白和RTP-26组成的融合蛋白。但是,用BrdU细胞增殖检测试剂盒测试,转染pEGFP-N1-NQO2质粒的平滑肌细胞与野生型细胞比较,增殖能力没有明显变化。5.RTP-26 RNA干扰慢病毒载体Psc-NQO2构建成功后,转染血管平滑肌细胞72小时,细胞内RTP-26 mRNA的表达较野生型细胞减少74%。延长转染时间至14天,细胞内RTP-26蛋白的表达几乎检测不到。同时,用BrdU细胞增殖检测试剂盒测试,转染Psc-NQO2的平滑肌细胞与野生型细胞比较,增殖能力明显降低(P＜0.01),且与25μmol/L白藜三醇干预72小时的平滑肌细胞的增殖能力相仿。结论:1.用白藜三醇亲合层析柱可以从血管平滑肌中分离、纯化一个26kD的蛋白片断,即白藜三醇结合蛋白26(RTP-26),结合文献和western blot结果,证实RTP-26即NQO2;2.高胆固醇饲料喂养新西兰大白兔12周可产生动脉粥样硬化损伤;球囊内皮剥脱术可制备再狭窄动物模型。白藜三醇能够抑制动脉粥样硬化再狭窄的形成,这与其能够抑制血管壁内RTP-26 mRNA和蛋白的表达有关。3.白藜三醇能够抑制体外培养的血管平滑肌细胞的增殖;白藜三醇也能够抑制培养的平滑肌细胞胞浆内RTP-26 mRNA和蛋白的表达,且具有浓度依赖和时间依赖的特点;4.RTP-26高表达对血管平滑肌细胞的增殖无影响;5.RTP-26表达降低的血管平滑肌细胞增殖能力降低,且与白藜三醇干预的细胞的增殖能力相仿。