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本研究以泽泻为研究对象,以代谢组学研究方法为主线,结合血清生化指标、组织病理学切片、体外细胞毒性试验、体内吸收动力学和体外肝微粒体温孵育等研究方法,对其致肾毒性部位和毒效物质基础进行了初步筛选,并进一步对其致肾毒性成分之一泽泻醇A的体内药动学行为和体外代谢机制进行了研究,为阐明泽泻致肾损伤的机制和临床合理安全用药提供依据。研究内容如下:1.泽泻水煎液致肾毒性的大鼠尿液和血清代谢组学研究:以关木通为阳性对照中药,以血清生化指标和组织病理学为基础,建立了基于UPLC-MS的大鼠尿液、血清的代谢组学方法,并成功应用于长期大剂量给予泽泻水煎液后大鼠尿液和血清中的内源性代谢物变化的研究,对其致肾毒性的机制进行了探讨。在连续灌胃给药60 d和120d后,关木通阳性对照组大鼠的肌酐/体重(Scr/BW)值和尿素氮(BUN)值均显著高于正常对照组,且于给药120 d肾组织出现明显病理改变;在连续灌胃给药180 d后,泽泻水煎液组大鼠的Scr/BW值和BUN值均显著高于正常对照组,且肾组织出现明显病理改变,证明长期大剂量灌胃给予大鼠泽泻水煎液可引起肾损伤作用。在大鼠尿液和血清代谢组学研究中分别鉴定了与泽泻水煎液致肾毒性相关的10个和6个生物标记物,表现为:连续给药60 d后,尿液中马尿酸、肌酐、2,8-二羟基喹啉-β-D-葡萄糖醛酸苷、十六碳二氢(神经)鞘氨醇和二氢(神经)鞘氨醇等浓度升高,2,8-二羟基喹啉浓度降低;120 d后,尿液中马尿酸、十六碳二氢(神经)鞘氨醇和二氢(神经)鞘氨醇等浓度升高,肌酐和2,8-二羟基喹啉-β-D-葡萄糖醛酸苷等浓度降低;180 d后,尿液中十六碳二氢(神经)鞘氨醇、苯乙尿酸、胆酸和酮胆酸等浓度升高,马尿酸、肌酐和7-甲基鸟嘌呤等浓度降低。血清中胆酸、酮胆酸和溶血卵磷脂等浓度升高,苯丙氨酸和磷脂酰胆碱等浓度降低。2.泽泻水煎液致肾毒性部位筛选和毒效物质基础质谱鉴定:将泽泻水煎液用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后得到的萃取物分别加水稀释成为与泽泻水煎液致肾毒性相当剂量灌胃给予大鼠,以血清生化指标和组织病理学结果为依据,采用已建立的大鼠尿液、血清代谢组学方法,筛选出了泽泻水煎液致肾毒性的萃取部位,并应用HPLC-IT/MSn对该部位的主要化学成分进行了鉴定,确定了其致肾毒性作用的化学物质基础。泽泻水煎液氯仿萃取物组大鼠的Scr/BW值和BUN值显著高于正常对照组,且出现与灌胃给予泽泻水煎液大鼠肾组织相似的病理学改变;而其他各组大鼠的Scr/BW值和BUN值与正常对照组无显著差异,且未见明显病理学改变。这一结果从血清生化学和病理学方面表明泽泻水煎液氯仿萃取物为泽泻的致肾毒性部位。通过PCA分析,在大鼠尿液和血清样品的score图上氯仿萃取物组与正常对照组的距离均大于其它三组与正常对照组之间的距离;且氯仿萃取物致大鼠肾损伤的尿液和血清标记物与泽泻水煎液致大鼠肾损伤的标记物基本相同,这一结果从代谢组学方面揭示了泽泻水煎液致肾毒性部位为其氯仿萃取物。应用HPLC-IT/MSn联用技术对泽泻水煎液致肾毒性部位(即氯仿萃取物)进行了分离分析,确定了 17个色谱峰,并初步鉴定出10个化合物,均为原萜烷型四环三萜类化合物,分别为:alisol A,alisol A 23-acetate,alisol A 24-acetate,16-oxo-alisol A,13,17-epoxy-alisol A,alisol C,alisol C 23-acetate,alisol L,alisol M 和 alismaketone C 23-acetate 。3.泽泻醇A对人肾小管上皮细胞的毒性研究:以马兜铃酸为阳性对照药,将正常的HKC细胞暴露于泽泻醇A中,应用MTT法测定泽泻醇A和阳性对照药对HKC细胞的增殖抑制作用,并采用Hoechst 33342-PI荧光双染法观察细胞形态学变化。结果,泽泻醇A作用于HKC细胞24,48,72 h的最大增殖抑制率分别为67.29%,70.42%, 71.98%,IC50值分别为51.53, 27.05, 26.81 μg·ml-1;阳性对照药马兜铃酸作用于HKC细胞24,48, 72 h的最大增殖抑制率分别为39.06%, 66.15%, 69.70%,IC50值分别为98.5, 44.85,25.56 μg·ml-1。加入泽泻醇A和阳性对照药马兜铃酸的细胞在荧光显微镜下发出强蓝色荧光;随着药物浓度的增加可观察到红色荧光增加,且随着药物作用时间的延长可观察到细胞数目减少。4.泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇A大鼠体内吸收动力学研究:建立了同时测定大鼠血浆中泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇A的LC-MS分析方法,并对灌胃给予泽泻提取物后泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇A在大鼠体内的药动学行为进行了研究。结果表明两者在大鼠体内的药动学行为较为相似,均呈现明显的双峰现象。主要药动学参数tmax分别为9.7 ±0.5 h 和 9.2 ± 1.0 h,Cmax 分别为 476.1 ± 188.6 ng·ml-1 和 233.1 ± 55.4 ng·ml-1, 0/2 分别为3.1 ± 0.6 h 和 2.9 ± 0.9 h,AUC(0-24)分别为 2945 ± 1024 ng·h·ml-1 和 1820 ± 464 ng·h·ml-1,AUC(0-∞)分别为 3453 ± 1623 ng·h·ml-1 和 1874 ± 450 ng·h·ml-1。5.致肾毒性成分泽泻醇A的体外代谢研究:建立了测定肝微粒体样品中泽泻醇A的LC-MS方法,并将该方法成功地应用于泽泻醇A在大鼠和人肝微粒体(RLM和HLM)中的酶促反应动力学研究,和半定量分析泽泻醇A各代谢产物(M1～M6)的生成量以对参与生成各代谢产物的酶亚型进行确认研究;应用HPLC-Q-TOF/MS法对泽泻醇A在RLM, HLM和人重组CYP3A4酶孵育体系中的代谢产物进行了结构推测。在RLM孵育体系中确定了泽泻醇A的3个氧化代谢产物(M1～M3),分别为C-28 (或C-29)羟基化代谢产物、C-28 (或C-29)羟基化和C-23-OH羰基化代谢产物、C-23-OH羰基化代谢产物。HLM孵育体系中确定了泽泻醇A的6个氧化代谢产物(M1 ～ M6),其中M4和M5为C-羟基化代谢产物,M6为C-羟基化和C-OH羰基化代谢产物,具体结构未能明确。通过特异性化学抑制剂法和人源重组单纯酶法相结合,确定了 CYP3A4酶为催化泽泻醇A代谢生成各氧化代谢产物的主要代谢酶。