论文部分内容阅读
目的：
衰老是生命科学的热点课题，性激素分泌紊乱是机体衰老的重要病理进展，雌激素和雄激素除了分别由动物卵巢、胎盘和睾丸生成外，两者均存在于肾上腺皮质的类固醇激素合成途径中。维生素D轴与肾上腺皮质功能存在密切联系，维生素D对性激素分泌存在一定程度的调节作用。中医肾虚衰老学说被广泛认可，补肾是中医抗衰老的治疗原则。现代研究发现，肾虚衰老存在着肾上腺皮质功能衰退的共同病理表现。课题组前期研究发现，中医“肾藏精”功能与维生素D生物学功效相似，维生素D缺乏与肾虚证有着相同的病理改变，且通过相关实验证实，补肾中药存在对维生素D轴的调节作用。基于上述认识，拟运用经典补肾中药淫羊藿有效活性成分淫羊藿苷干预雄性衰老肾虚大鼠，通过观察对其维生素D轴和性激素分泌及相关基因的影响，初步探讨淫羊藿苷抗衰老的可能机制，为中医药抗衰老提供新的作用靶点和思路。
方法：
1.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠模型的影响：雄性SD大鼠分为青年对照组（生理盐水，8.0ml/kg/d），衰老组（生理盐水，8.0ml/kg/d），淫羊藿苷低剂量组（淫羊藿苷，30mg/kg/d），淫羊藿苷中剂量组（淫羊藿苷，60mg/kg/d），淫羊藿苷高剂量组(淫羊藿苷，120mg/kg/d)，维生素D组（维生素D，30ng/kg/d），9只/组。除青年对照组外，其余行D-半乳糖（125mg/kg）颈背部注射持续60天。各组对应药物灌胃60天。观察并记录。无痛处死大鼠，采集血清，-80℃冻存;采集左侧肾上腺皮质，RNA保存液浸泡，-80C冻存;采集右侧肾上腺皮质，4％多聚甲醛浸泡，常温保存。
2.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质组织病理的影响：取右侧肾上腺皮质，HE染色光学显微镜下观察淫羊藿苷对各组大鼠肾上腺皮质组织病理的影响。
3.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮、睾酮含量的影响：取血清，Elisa法检测淫羊藿苷对各组大鼠血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮、睾酮水平的影响。
4.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质VDR、CYP24A1、CYP27B1、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达的影响：取左侧肾上腺皮质，RT-qPCR法检测淫羊藿苷对各组大鼠肾上腺皮质维生素D轴相关基因VDR、CYP24A1、CYP27B1mRNA和性激素合成相关基因CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达的影响。
5.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质VDR、CYP24A1、CYP27B1蛋白表达的影响：取左侧肾上腺皮质，Western Blot法检测淫羊藿苷对各组大鼠肾上腺皮质维生素D轴相关蛋白VDR、CYP24A1、CYP27B1表达的影响。
结果：
1.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠模型的影响：与青年对照组相比，衰老组大鼠神气不足、肌肉较瘦弱、毛色枯槁微黄无光、竖毛、眼神晦暗、舌下静脉紫暗、粪粒偏软、食少、活动度低下、嗜睡懒动、喜抱群倦卧;经淫羊藿苷干预后与衰老组相比，中药干预组排尿明显增多，食欲增强，部分大鼠活动度增强，出现轻微兴奋易激惹表现;与衰老组相比，维生素D组表现未见明显差异。
2.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质组织病理的影响：与青年对照组比较，衰老组球状带细胞较多，核深染;束状带细胞排布散乱，细胞间隙明显增宽，胞内空泡较少，细胞核深染密集，嗜碱性较强;网状带边界模糊不清，束状带细胞不规则侵入，细胞排布较紊乱，未索状交织呈整体团块，胞浆空泡较少，深染胞核较多，存在细胞固缩现象。与衰老组比较，维生素D组球状带肉眼未见明显差异;束状带细胞排布恢复规则成柬，细胞体积明显增大，细胞间隙减小，细胞质嗜碱性明显较弱，胞内空泡脂滴分布增多，细胞核大而排布疏散，核染色较浅，核仁明显;网状带边界恢复清晰，细胞排布较紧密，呈网状团块。与衰老组比较，淫羊藿苷高剂量组束状带细胞排布明显紧密规则，中、低剂量组束状带仍存在少量细胞间隙，低剂量组网状带边界恢复清晰显著。
3.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮、睾酮含量的影响：与青年对照组比较，衰老组的血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮水平均较低(P＜0.05)，睾酮水平则较高(P＜0.05)，雌激素/睾酮比例显著降低;与衰老组比较，淫羊藿苷高剂量组的血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮水平均升高(P＜0.05)，睾酮水平则降低(P＜0.05)，雌激素/睾酮比例显著升高;与衰老组比较，维生素D组除孕酮水平变化未见明显差异外，血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕烯醇酮水平均升高(P＜0.05)，睾酮水平明显下降(P＜0.05)。
4.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质VDR、CYP24A1、CYP27B1、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达的影响：与青年对照组比较，衰老组的VDR、CYP24A1mRNA表达升高(P＜0.05)，与青年对照组比较，衰老组的CYP27B1、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达则降低(P＜0.05)。与衰老组比较，维生素D组和淫羊藿苷高、中、低剂量组的VDR、CYP24A1mRNA表达均下调(P＜0.05)。与衰老组比较，维生素D组和淫羊藿苷高、中、低剂量组的CYP27B1、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达均上调(P＜0.05)。
5.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质VDR、CYP24A1、CYP27B1蛋白表达的影响：与青年对照组比较，衰老组的VDR、CYP24A1蛋白表达显著升高(P＜0.05)，而CYP27B1蛋白表达则降低。与衰老组比较，淫羊藿苷高、中、低剂量组和维生素D组的VDR、CYP24A1蛋白表达均下调;与衰老组比较，除淫羊藿苷低剂量组无显著改变外，其余药物干预组的CYP27B1蛋白表达均上调(P＜0.05)。
结论：
1.衰老肾虚雄性大鼠维生素D轴功能减弱，肾上腺皮质性激素合成功能明显紊乱。
2.淫羊藿苷能通过调节维生素D轴改善衰老肾虚雄性大鼠肾上腺皮质性激素分泌发挥抗衰老功效。
衰老是生命科学的热点课题，性激素分泌紊乱是机体衰老的重要病理进展，雌激素和雄激素除了分别由动物卵巢、胎盘和睾丸生成外，两者均存在于肾上腺皮质的类固醇激素合成途径中。维生素D轴与肾上腺皮质功能存在密切联系，维生素D对性激素分泌存在一定程度的调节作用。中医肾虚衰老学说被广泛认可，补肾是中医抗衰老的治疗原则。现代研究发现，肾虚衰老存在着肾上腺皮质功能衰退的共同病理表现。课题组前期研究发现，中医“肾藏精”功能与维生素D生物学功效相似，维生素D缺乏与肾虚证有着相同的病理改变，且通过相关实验证实，补肾中药存在对维生素D轴的调节作用。基于上述认识，拟运用经典补肾中药淫羊藿有效活性成分淫羊藿苷干预雄性衰老肾虚大鼠，通过观察对其维生素D轴和性激素分泌及相关基因的影响，初步探讨淫羊藿苷抗衰老的可能机制，为中医药抗衰老提供新的作用靶点和思路。
方法：
1.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠模型的影响：雄性SD大鼠分为青年对照组（生理盐水，8.0ml/kg/d），衰老组（生理盐水，8.0ml/kg/d），淫羊藿苷低剂量组（淫羊藿苷，30mg/kg/d），淫羊藿苷中剂量组（淫羊藿苷，60mg/kg/d），淫羊藿苷高剂量组(淫羊藿苷，120mg/kg/d)，维生素D组（维生素D，30ng/kg/d），9只/组。除青年对照组外，其余行D-半乳糖（125mg/kg）颈背部注射持续60天。各组对应药物灌胃60天。观察并记录。无痛处死大鼠，采集血清，-80℃冻存;采集左侧肾上腺皮质，RNA保存液浸泡，-80C冻存;采集右侧肾上腺皮质，4％多聚甲醛浸泡，常温保存。
2.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质组织病理的影响：取右侧肾上腺皮质，HE染色光学显微镜下观察淫羊藿苷对各组大鼠肾上腺皮质组织病理的影响。
3.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮、睾酮含量的影响：取血清，Elisa法检测淫羊藿苷对各组大鼠血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮、睾酮水平的影响。
4.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质VDR、CYP24A1、CYP27B1、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达的影响：取左侧肾上腺皮质，RT-qPCR法检测淫羊藿苷对各组大鼠肾上腺皮质维生素D轴相关基因VDR、CYP24A1、CYP27B1mRNA和性激素合成相关基因CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达的影响。
5.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质VDR、CYP24A1、CYP27B1蛋白表达的影响：取左侧肾上腺皮质，Western Blot法检测淫羊藿苷对各组大鼠肾上腺皮质维生素D轴相关蛋白VDR、CYP24A1、CYP27B1表达的影响。
结果：
1.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠模型的影响：与青年对照组相比，衰老组大鼠神气不足、肌肉较瘦弱、毛色枯槁微黄无光、竖毛、眼神晦暗、舌下静脉紫暗、粪粒偏软、食少、活动度低下、嗜睡懒动、喜抱群倦卧;经淫羊藿苷干预后与衰老组相比，中药干预组排尿明显增多，食欲增强，部分大鼠活动度增强，出现轻微兴奋易激惹表现;与衰老组相比，维生素D组表现未见明显差异。
2.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质组织病理的影响：与青年对照组比较，衰老组球状带细胞较多，核深染;束状带细胞排布散乱，细胞间隙明显增宽，胞内空泡较少，细胞核深染密集，嗜碱性较强;网状带边界模糊不清，束状带细胞不规则侵入，细胞排布较紊乱，未索状交织呈整体团块，胞浆空泡较少，深染胞核较多，存在细胞固缩现象。与衰老组比较，维生素D组球状带肉眼未见明显差异;束状带细胞排布恢复规则成柬，细胞体积明显增大，细胞间隙减小，细胞质嗜碱性明显较弱，胞内空泡脂滴分布增多，细胞核大而排布疏散，核染色较浅，核仁明显;网状带边界恢复清晰，细胞排布较紧密，呈网状团块。与衰老组比较，淫羊藿苷高剂量组束状带细胞排布明显紧密规则，中、低剂量组束状带仍存在少量细胞间隙，低剂量组网状带边界恢复清晰显著。
3.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮、睾酮含量的影响：与青年对照组比较，衰老组的血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮水平均较低(P＜0.05)，睾酮水平则较高(P＜0.05)，雌激素/睾酮比例显著降低;与衰老组比较，淫羊藿苷高剂量组的血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕酮、孕烯醇酮水平均升高(P＜0.05)，睾酮水平则降低(P＜0.05)，雌激素/睾酮比例显著升高;与衰老组比较，维生素D组除孕酮水平变化未见明显差异外，血清25(OH)2D3、1，25(OH)2D3、雌二醇、孕烯醇酮水平均升高(P＜0.05)，睾酮水平明显下降(P＜0.05)。
4.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质VDR、CYP24A1、CYP27B1、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达的影响：与青年对照组比较，衰老组的VDR、CYP24A1mRNA表达升高(P＜0.05)，与青年对照组比较，衰老组的CYP27B1、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达则降低(P＜0.05)。与衰老组比较，维生素D组和淫羊藿苷高、中、低剂量组的VDR、CYP24A1mRNA表达均下调(P＜0.05)。与衰老组比较，维生素D组和淫羊藿苷高、中、低剂量组的CYP27B1、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1mRNA表达均上调(P＜0.05)。
5.淫羊藿苷对衰老肾虚大鼠肾上腺皮质VDR、CYP24A1、CYP27B1蛋白表达的影响：与青年对照组比较，衰老组的VDR、CYP24A1蛋白表达显著升高(P＜0.05)，而CYP27B1蛋白表达则降低。与衰老组比较，淫羊藿苷高、中、低剂量组和维生素D组的VDR、CYP24A1蛋白表达均下调;与衰老组比较，除淫羊藿苷低剂量组无显著改变外，其余药物干预组的CYP27B1蛋白表达均上调(P＜0.05)。
结论：
1.衰老肾虚雄性大鼠维生素D轴功能减弱，肾上腺皮质性激素合成功能明显紊乱。
2.淫羊藿苷能通过调节维生素D轴改善衰老肾虚雄性大鼠肾上腺皮质性激素分泌发挥抗衰老功效。