研究背景和目的肝细胞癌是起源于肝细胞的肿瘤,是肝脏最常见的原发肿瘤,在全世界内,排在男性恶性肿瘤第五位,排在女性恶性肿瘤第七位。我国属于肝癌高发地区,占世界肝癌发病率的一半左右。流行病学研究显示,肝癌发生与HBV感染、HCV感染,黄曲霉毒素,酗酒等因素相关。在我国,肝癌主要由于HBV感染密切相关引起,大约75%-80%原发性肝癌患者HBs Ag检测阳性。HBV引起的肝炎-肝硬化-肝癌这样三步基本过程,而我国乙肝病毒携带者将近一亿人,导致每年大量新发肝癌病例,防控形势十分严峻。尽管部分早期肝癌患者经手术切除或肝移植有治愈的可能,但是大部分肝癌患者确诊时已属于肝癌晚期,无法进行手术切除,只有采取姑息治疗。随着医学研究及技术进步,多种新理论和方法应用于肝癌治疗,综合治疗有效提高了肝癌的生存率。大量研究表明,肝癌发生发展中存在多个促癌信号通路的异常激活,例如EGF/IGF/HGF信号通路,RAS/MAPK通路,AKT/m TOR通路,TGF-β通路以及Wnt-βcatenin信号通路等。因此,针对阻断这些促癌信号通路关键节点分子的靶向药成为治疗肝癌新药开发的热点。新型的生物靶向药物的出现给肝癌治疗带来了新的希望,然而,肝癌患者中存在很强的异质性,促癌通路的激活并非一致,这使得很多针对个别促癌通路的抑制剂临床试验宣告失败,例如EGF信号通路阻断剂恩罗替尼。2007年靶向肝癌治疗的领域有了重大的突破。多激酶抑制剂索拉非尼的三期临床试验表明口服索拉非尼可以显著提高晚期肝癌的生存率。索拉非尼是一种多激酶抑制剂,通过抑制丝氨酸/苏氨酸激酶(B-RAF)、受体酪氨酸激酶(VEGFR2,PDGFR,c-Kit受体)从而抑制肿瘤增殖及其血管生成。索拉非尼已经获得美国食品药品管理局(FDA)批准,成为目前唯一口服的晚期肝癌治疗靶向药物。然而后续索拉非尼研究进展显示其疗效个体差异十分明显,因此阐明索拉非尼的作用原理、代谢方式及最大化其生物活性作用对于索拉非尼个体化治疗的选择至关重要。UGT1A9是索拉非尼在体内的二相代谢酶,通过转移葡萄糖醛酸基团,增加索拉非尼亲水性,利于其排出体内,其在转录水平及转录修饰的机制研究较多,而其在表观水平的调控机制鲜有报道。mi RNA是一种生物体内产生的小RNA,长度大约20-25个核苷酸,在表观遗传学调控方面发挥重要作用,通过与靶基因3′-UTR互补配对起到对靶基因的调节作用,其作用机制与互补程度密切相关,完全互补切断靶基因,降解下调靶基因,不完全互补抑制靶基因。本研究旨在通过探讨mi RNA对二相代谢酶UGT1A9的调节,探索对于索拉非尼代谢及其药效的影响,从而为索拉非尼临床用药提供重要的科学依据。研究方法1.PCR检测细胞系及肝癌及癌旁组织中CYP3A4及UGT1A9的表达情况。2.利用生物信息学分析软件,预测作用于UGT1A9的候选mi RNA。3.通过将候选mi RNA转染高表达UGT1A9的SMMC-7721细胞,抽提RNA,反转录,利用RT-PCR检测mi RNA对UGT1A9表达的影响,验证候选mi RNA。4.通过构建过表达UGT1A9的3′-UTR报告基因质粒,质粒及候选mi RNA共转HEK293T细胞,利用报告基因实验进一步验证候选mi RNA。5.利用东方肝胆外科医院样本库收集的肝细胞癌病人肝癌及癌旁组织,提取RNA,反转录,设计UGT1A9及候选mi RNA检测引物,RT-PCR检测UGT1A9及候选mi RNA在肝脏及肝癌组织中的表达情况,利用SPSS软件分析UGT1A9及mi RNA表达的相关性,检测体内调节UGT1A9的mi RNA。6.构建UGT1A9的3′-UTR突变体报告基因质粒,进一步验证候选mi RNA。7.利用CCK8实验检测细胞系经sorafenib刺激后的增殖情况。8.构建UGT1A9过表达细胞系Huh7、干扰细胞系SMMC-7721,细胞培养基中加入索拉非尼刺激,利用CCK8检测细胞增殖变化,观察索拉非尼的药效。9.mi R-200a-3p及mi R-183-5p瞬时转染SMMC-7721细胞,培养基中使用索拉非尼刺激,利用CCK8检测细胞增殖变化,从而反应索拉非尼的药效,同时质谱分析细胞培养上清及细胞裂解液,分析索拉非尼代谢产物的变化。10.收集东方肝胆外科医院肝癌病人蜡块组织,制作组织芯片,利用免疫组化检测癌和癌旁中UGT1A9表达,利用SPSS软件分析UGT1A9表达与服用索拉非尼病人预后的相关性。11.PCR检测肝细胞癌病人肝癌及癌旁组织中索拉非尼代谢产物转运体P-gp、BRCP、MRP2表达情况,分析肿瘤中药物转运情况。结果1.PCR检测肝癌细胞系、原发性肝癌患者肝癌及癌旁组织中CYP3A4及UGT1A9的表达情况,已检测的永生化细胞系均未见CYP3A4的表达,其中MHCC-97H,SMMC-7721高表达UGT1A9;Huh7,PLC,PVTT,Hep G2低表达UGT1A9,癌旁组织中这两种蛋白表达高于肝癌组织。2.利用生物信息学软件Targetscan、mi RDB和mi Rande预测可能作用于UGT1A9的候选mi RNA共47个。3.将软件预测的47个外源性mi RNA-mimic转入SMMC-7721细胞,其中12个mi RNA-minic致使UGT1A9在m RNA水平表达下降50%以上。4.构建过表达UGT1A9的3′-UTR报告基因质粒,将质粒及候选mi RNA共转HEK-HEK293T细胞,利用报告基因实验检测荧光素酶活性,将上述候选mi RNA缩减为11个。5.上述11个mi RNA中,其中3个在人体肝脏及肝癌组织中未见表达,另外8个在肝脏中有表达,检测8个候选mi RNA在肝脏中的表达后发现mi RNA-200a-3p以及mi RNA-183-5p的表达UGT1A9表达呈负相关。6.构建候选mi RNA作用位点UGT1A9 3′-UTR突变体报告基因质粒,将该质粒与候选mi RNA-mimic共转HEK293T细胞,细胞裂解液利用报告基因实验检测荧光素酶活性后发现,突变UGT1A9 3′-UTR后荧光素酶活性未见明显变化。7.细胞系经sorafenib刺激72小时后,利用CCK8检测增殖情况,发现高表达UGT1A9的细胞系(MHCC-97H,SMMC-7721)增殖情况优于低表达UGT1A9的细胞系(Huh7,PLC,PVTT以及He PG2)。8.过表达UGT1A9细胞系Huh7、干扰细胞系SMMC-7721,索拉非尼刺激,CCK8实验检测发现细胞增殖情况无明显变化。9.mi R-200a-3p,mi R-183-5p转染SMMC-7721细胞,索拉非尼刺激,CCK8实验检测细胞增殖未见明显变化,对索拉非尼药效无明显影响;然而质谱分析发现转染mi RNA后葡萄糖醛酸化索拉非尼明显减少。10.免疫组化检测UGT1A9表达,利用SPSS软件分析UGT1A9表达与服用索拉非尼病人预后明显相关,肝癌组织中高表达UGT1A9病人预后优于低表达UGT1A9病人。11.PCR检测发现肝细胞癌病人肝癌及癌旁组织中转运体P-gp、BRCP、MRP2表达存在明显差异,癌中转运体表达下调,可能影响药物转运,导致癌中高表达UGT1A9病人生存期优于低表达UGT1A9病人。结论本研究首次发现mi R-200a-3p,mi R-183-5p mimic转入SMMC-7721内,明显抑制UGT1A9 m RNA水平,同时sorafenib代谢产物葡萄糖醛酸化的索拉非尼(sorafenib-glucuronide)明显减少。mi R-200a-3p,mi R-183-5p是UGT1A9重要的调控因子,肝癌组织中高表达UGT1A9提示预后优于低表达病人。肝癌组织中高表达UGT1A9可以作为提示服用索拉非尼预后良好的潜在指标。