背景与目的:竹叶青蛇（Trimeresurus stejnegeri）是我国十大毒蛇之一,其分泌毒液主要是血液循环毒素。广西位于中国的西南部,属亚热带气候,有多种毒蛇,据王乃平等研究,广西蛇伤中竹叶青蛇伤排名第二,是蛇伤的主要蛇种。竹叶青蛇咬伤主要在城市园林、田野和森林等地方,临床上可分为轻型、中型和重型,主要表现以血液功能障碍和肢体肿胀为主,严重患者会出现弥散性血管内凝血（Disseminated Intravascular Coagulation;DIC）,凝血机制被广泛激活,小血管内纤维蛋白沉积导致组织和器官损伤;另一方面,竹叶青蛇毒消耗凝血因子引起全身性出血,严重时导致多脏器功能障碍或衰竭最终死亡。目前,由于缺乏良好的动物模型,以致对竹叶青蛇咬伤后不能很好连续动态的观察其生理病理过程,给更深入研究其病理机制带来困难。因此,本研究以广西巴马小型香猪作为竹叶青蛇咬伤的动物模型,建立一种合理性、安全性、连续性和稳定性较好的动物模型,以解决目前尚无竹叶青蛇咬伤大型动物模型问题。竹叶青蛇咬伤猪模型的构建,可以连续动态检测其血液指标变化,研究竹叶青蛇咬伤的病理学机制,并可采用代谢组学方法分析血清和尿液的差异代谢物,筛选可用于判定咬伤蛇种及协助诊断的生物标记物。代谢组学是近年来医药学研究领域的热点之一,可以直观反应生物体内的代谢物变化从而解释机体的生理病理状态下代谢物的组成特点及变化规律,现已广泛应用到药理毒理学、疾病诊断、营养食品科学等重要领域。本研究通过建立竹叶青咬伤模型,采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS）的代谢组学方法,分析和筛选竹叶青蛇咬伤的血清和尿液代谢中标志物,以期为竹叶青咬伤提供可靠及有效的临床诊断标志物,为竹叶青蛇咬伤的精准治疗奠定基础。方法:1.构建竹叶青蛇咬伤广西巴马小香猪的动物模型以竹叶青蛇毒对小鼠肌肉注射的LD50值为依据,通过等效剂量系数折算法和体表面积换算法,计算竹叶青蛇毒对巴马小香猪的理论半数致死量。12只巴马小香猪随机分为对照组6只和竹叶青蛇毒组6只,竹叶青蛇毒组以竹叶青蛇毒对巴马小香猪的理论半数致死量的1/3为注射量,0.2ml/kg肌肉注射,对照组注射等量的生理盐水。注射蛇毒后观察巴马小香猪的中毒症状,在注射蛇毒前、注射蛇毒后3-72小时分段采集两组猪的血液和尿液,检测血常规和凝血项目等,通过病理HE染色观察心脏组织、肺组织、肝组织、肾组织、十二指肠和注射部位肌肉组织病理学变化。2.竹叶青蛇咬伤猪的血清及尿液代谢组学分析采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）的代谢组学技术,分析竹叶青蛇毒组和对照组猪中血清和尿液的代谢轮廓:第一步,血清进行冷乙腈除蛋白法处理,尿液进行冷甲醇处理;然后进行液-质谱联用分析,获得竹叶青蛇咬伤后血清和尿液代谢整体轮廓数据。第二步,对获得数据进行多元变量统计分析。先通过主成份分析（PCA）方法,全面分析各组实验数据,大体得出群落与分离的趋势,再通过有监督的正交偏最小二乘判别分析方法（OPLS-DA）和变化倍数法（Fold Change）,筛选出蛇毒组与对照组差异的潜在代谢物离子。第三步,将获得的潜在差异离子质谱精确质量数与Medlin数据库和KEGG比对,并结合离子分解规律和统计学意义筛选血清和尿液中潜在的竹叶青蛇咬伤代谢物。结果:1.竹叶青蛇咬伤小猪模型竹叶青蛇毒组小猪伤口处出现肿胀并伴有血水泡,患肢和周围红肿,迅速向近心端蔓延,小猪疼痛不安,不进食或少食,腹泻等症状,实验期间未见动物死亡。竹叶青蛇毒组与对照组小猪相比红细胞、白细胞、谷丙转氨酶和D二聚体均升高,凝血酶原时间增加。而血小板、K+浓度和纤维蛋白原降低（减少）。病理常规H-E染色发现,与对照组相比,竹叶青蛇毒组小猪肺组织毛细血管通透性增加,有充血水肿现象;十二指肠黏膜水肿,充血、糜烂;注射处肌肉组织可见水肿、出血、变性坏死的改变;其他器官组织未见明显异常。此方法可以较好地建立竹叶青蛇咬伤小猪动物模型,注射蛇毒后6-24小时能够反映竹叶青蛇咬伤的病理生理过程,具有较好的操作性及可重复性,可用于竹叶青蛇咬伤的病理生理等机制研究。2.代谢组学分析结果超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-QTOF-MS/MS）血清正离子模式下获得685个色谱峰,负离子模式获得528个色谱峰。超高效液相色谱-质谱联用尿液正离子模式下获得651个色谱峰,负离子模式获得640个色谱峰。数据的可靠性分析表明PCA和OPLS-DA分析可以将两组猪的血清样品较好的区分,PCA在正、负离子模式显示两组样本之间分离程度及聚类情况较好;OPLS-DA分析能将两组样本精确分开,表明该组数据的差别主要来自组间差异,对OPLS-DA模型进行7次循环交互验证实验,结果排除了该模型中数据的随机效应。综合变异倍数分析和T检验两种单变量分析以及R语言火山图的结果,更加直观地显示出两样本间代谢物具有显著性的变化。3.差异代谢物筛选血清质谱分析结果发现其中正离子模式下鉴定到685个化合物,筛选得出367个差异代谢物。负离子模式下鉴定到528个化合物,筛选出277个差异代谢物。血清正负两种模式下都存在的差异代谢物为9个,分别为2-酰基-1-（1-烯基）-sn-甘油-3-磷酸卵磷脂（2-Acyl-1-（1-alkenyl）-sn-glycero-3-phosphate）,牛磺胆酸（Lithocholyltaurine）,油酸（Oleic acid）,石胆酸（Lithocholic acid）,脱氧胆酸（Deoxycholic acid）,次黄嘌呤（Hypoxanth ine）,苯乙醛（Phenylacetaldehyde）,γ-亚麻酸（Gamma-Linolenic acid）,色氨酸（Tryptophan）。尿液质谱分析结果发现其中正离子模式下鉴定到651个化合物,筛选出292个差异代谢物。负离子模式下鉴定到640个化合物,筛选出326个差异代谢物。血清正负两种模式下都存在的差异代谢物为11个,分别为3-甲氧基-4-羟苯基乙二醇葡糖醛酸（3-Methoxy-4-hydroxypheny lglycol glucuronide）,3,4-苯并（3,4-Benzopyrene）,多巴胺（Dopamine）,硫代半胱氨酸（Thiocysteine）,精氨酸（Arginine）,吲哚乙醛（Indoleacetal dehyde）,5-羟基吲哚乙酸（5-Hydroxyindoleacetic acid）,D-葡萄糖醛酸-6,3-内酯（D-Glucurono-6,3-lactone）,5-戊酰胺戊酸酯（5-Acetamidovalerate）,二氢脂酰胺（Dihydrolipoamide）,硫酸脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosteron e sulfate）。4.差异代谢物的生物信息学分析结果Metabo Analyst 5.0分析发现竹叶青蛇咬伤小猪的差异代谢物,血清主要参与5条代谢通路,分别为色氨酸尿症（Tryptophanuria）,囊性纤维化引起的肝病（Liver disease due to cystic fibrosis）,哈特纳普病（Hartnup disease）,高压氧暴露（Hyperbaric oxygen exposure）和胆汁性肝硬变（Biliary cirrhosis）,五条通路关系密切,这些通路上的核心代谢物脱氧胆酸、石胆酸、色氨酸、次黄嘌呤的含量在竹叶青蛇咬伤中发生了显著改变。尿液中芳香族L-氨基酸脱羧酶（Aromatic L-Amino Acid Decarboxylase）,白癜风（Vitiligo）,蓝色尿综合征（Blue Diaper Syndrome）和高精氨酸血症（Hyperargininemia）四条通路有统计学意义,这些通路上的核心代谢物为多巴胺、5-羟基吲哚乙酸和精氨酸。结论:1.本研究首次探索构建竹叶青蛇咬伤大型动物模型的方法。首先以昆明小鼠实验得出竹叶青蛇毒对小鼠的半数致死量,通过等效剂量系数折算法和体表面积法进行换算,得出竹叶青蛇毒对巴马小香猪的理论半数致死量,根据这个理论的半数致死量建造广西巴马小香猪的动物模型,构建符合竹叶青蛇咬伤的临床发病特点动物模型,为研究竹叶青蛇咬伤的病理生理机理及药物治疗等方面提供可靠动物模型。2.本研究基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪的代谢组学方法全面分析竹叶青蛇咬伤后血液的整体代谢轮廓,根据文献报道和相关通路分析筛选,血液中4种代谢物,脱氧胆酸、石胆酸、色氨酸和次黄嘌呤和尿液中3种代谢物,多巴胺、精氨酸和5-羟基吲哚乙酸跟竹叶青蛇咬伤的病理生理学相关,可能为竹叶青蛇咬伤提供可能的生物标志物及进一步研究竹叶青咬伤动态的生理学与病理学研究作基础。3.差异代谢物参与的代谢通路深入研究发现,竹叶青蛇咬伤能影响机体内肝脏代谢,色氨酸代谢,氨基酸脱羧酶代谢和高精胺酸血症代谢等重要代谢通路,这些通路上的核心代谢物脱氧胆酸、石胆酸、色氨酸和次黄嘌呤和多巴胺、精氨酸和5-羟基吲哚乙酸的量在竹叶青蛇咬伤中发生了显著改变。