Nlrp1引起小鼠视神经钳夹伤后RGCs死亡作用的研究

来源 :中国人民解放军陆军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jianyu128
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外伤性视神经病变是一种重要的致盲性眼病。直接或者间接的暴力撞击常常使视神经管骨折,视神经轴突挫伤,断裂,组织水肿,血液循环障碍导致视网膜神经节细胞继发性死亡,视力不可逆地丧失,目前尚缺乏有效的治疗手段。研究表明视神经损伤后神经节细胞存活的数量与视力的预后呈正性相关,因此如何减少视网膜神经节细胞的继发性死亡是视神经损伤后视力恢复的关键。视神经损伤后自由基增多,钙超载,促炎因子的释放等都会导致视网膜神经节细胞的死亡,这些因素中神经炎症是导致视网膜神经节细胞继发性死亡的一个重要的原因[1]。神经炎症包括感染性和非感染性,但在闭合性视神经损伤中非感染的无菌性炎症占主导。炎症是一把“双刃剑”,适当的炎症有助于感染控制和细胞生长修复,而过度地不可控的炎症可引起组织慢性持续的损伤,导致机体炎症性及自身免疫性疾病的发生。炎症的调控复杂多变,寻找导致闭合性视神经病变中过度的无菌性炎症反应的关键分子,通过调控靶点,减少神经节细胞的继发性死亡,是我们迫切需要解决的问题。炎症小体是一种多蛋白复合物,大部分经典的炎症小体由NLRs家族和ALRs家族成员识别病原体及DAMP[2,3]后,自动寡聚并募集其余的炎症成分,使Pro-caspase-1,Pro-IL-1β,Pro-IL-18活化,并发挥相应生物学功能。炎症小体在中枢神经系统疾病中广泛表达,在颅脑[4],脊髓[5,6]等损伤性疾病中加剧无菌性炎症,恶化病情。并且已有文献[7]证实在小鼠视神经钳夹伤中Nlrp3促使小胶质细胞活化,释放炎症介质,导致视网膜神经节细胞死亡,而通过基因敲除可延缓神经节细胞的死亡。由此可见炎症小体在视神经损伤中亦有关键作用。而目前已知的炎症小体有10余种,除Nlrp3外,其余炎症小体是否参与视神经损伤后的病理进程尚不清楚,需要进一步研究。炎症小体不仅释放促炎因子,还参与细胞死亡的调控,即细胞焦亡。细胞焦亡是一种炎症性死亡,可以刺激机体产生强免疫原性,并形成恶性循环,使组织长期处于失控的炎症状态,导致细胞不断死亡。目前普遍认为外伤性视神经病变中视网膜神经节细胞的死亡方式主要是凋亡,但有学者研究发现阻断凋亡执行酶Caspase-3,仅能阻止部分神经节细胞死亡,由此可以看出外伤性视神经病变中可能存在其它核心分子调控细胞死亡。而在小鼠眼球爆炸伤的视网膜上发现有细胞焦亡现象[8]的存在,是否是视网膜神经节细胞发生焦亡,又是何种炎症小体导致该细胞的焦亡并不清楚,需深入研究。本研究中,我们首先采用荧光定量PCR的方法对无菌条件下和非无菌条件下小鼠视神经钳夹伤术后视网膜组织进行炎症小体及相关炎症因子的基因筛查,并用Western Blot验证,探讨炎症小体在两种不同条件下的基因表达是否存在差异,及何种炎症小体在视神经钳夹伤术后的无菌性炎症中具有重要作用;接着用荧光定量PCR的方法筛查细胞死亡关键酶,来初步探讨视网膜细胞的死亡形式;并在接下来培养的小鼠视网膜神经节细胞糖氧剥夺/复氧模型中行Nlrp1,mature IL-1β,Cleaved-caspase-1的Western Blot检测,细胞LDH释放及Tunel染色来探讨炎症小体Nlrp1与视网膜神经节细胞死亡的关系;最后在细胞的糖氧剥夺/复氧模型中加入Caspase-1抑制剂VX765,进一步探讨Caspase-1与神经节细胞的焦亡关系。主要结果:第一部分:在该实验中我们发现小鼠视神经钳夹伤模型中视网膜神经节细胞死亡的高峰出现在术后7d;该模型在无菌条件和非无菌条件下Nlrp1b,Nlrp2,Nlrp3,AIM2,Naip/Nlrc4 mRNA的基因水平均有不同程度表达,且术后7d是表达高峰,而Nlrp5,Nlrp6,Nlrp7,Nlrp12未检测出有mRNA表达;非无菌条件下炎症小体Nlrp2,AIM2,Naip/Nlrc4 mRNA表达明显升高,而无菌条件下其mRNA表达升高不明显。在无菌条件下,Nlrp3和Nlrp1b的基因在术后不同时间点升高程度不同,两者基因表达高峰分别出现在在术后3d,7d,其中Nlrp1在视网膜神经节上有表达,且蛋白表达规律与基因表达规律相一致;炎症小体相关的炎症因子IL-1β在钳夹伤术后蛋白水平和基因水平均有增高,且高峰出现在术后7d。第二部分:其次我们发现在视神经钳夹伤中,细胞死亡相关因子Caspase-1和Caspase-3的基因在术后3d、7d、14d均有不同程度升高,而Caspase-1基因表达高峰在术后7d,Caspase-3的基因表达高峰在术后3d;RIPK3的基因表达在术后1d,3d,7d均有增高,其中术后3d出现表达高峰;而PARP-1[9]和GPX4[10]的基因表达无统计学意义;其中Caspase-1基因及蛋白表达在该模型中变化幅度最大,并确定其在视网膜神经节细胞上有表达;在糖氧剥夺/复氧的原代小鼠视网膜神经节细胞模型中发现Nlrp1,Caspase-1,IL-1β均有表达,且随复氧时间的推移而表达增强,而此过程中细胞死亡数目逐渐增加,并且伴有LDH释放。(3)最后,我们发现在糖氧剥夺/复氧的细胞模型中,不同浓度的Caspase-1抑制剂VX765对活化的Caspase-1均有一定的抑制作用,但5μMol/L效果较其余两组弱,而10μMol/L组和20μMol/L组无统计学差异;在糖氧剥夺/复氧细胞模型中加入浓度为10μMol/L VX765,mature IL-1β蛋白被明显抑制,且细胞死亡明显减少。主要结论:1、小鼠视神经钳夹伤后,无菌条件下及非无菌条件下炎症小体的激活类型不同,炎症小体Nlrp2,AIM2,Naip/Nlrc4参与感染性的神经炎症,而Nlrp3,Nlrp1b在感染性和非感染的神经炎症中均占有重要地位,且其可能在闭合性视神经损伤的无菌性炎症的不同时期发挥不同的作用,共同导致视网膜神经节细胞数量的减少。2、细胞程序性坏死,细胞凋亡和细胞焦亡在视神经钳夹伤的不同时期发挥不同作用,而多聚ADP核糖聚合酶-1依赖性细胞死亡及铁死亡并未启动,其中炎症小体Nlrp1/Caspase-1途径导致的细胞焦亡是外伤性视神经病变亚急性期神经节细胞死亡的主要方式。3、在外伤性视神经病变的体外模型中进一步证实视网膜神经节细胞的死亡形式是焦亡而非坏死;而Caspase抑制剂VX765可以显著抑制caspase-1的活性,且其终浓度为10μMol/L能有效抑制糖氧剥夺/复氧模型中神经节细胞的焦亡。
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