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利用FSH-hCG法对大耳白兔超排处理,用外科手术法采取输卵管内2-细胞期胚胎进行胚胎体外培养实验,研究活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)—过氧化氢(H2O2)对兔2-细胞期胚胎体外发育的影响,寻找胚胎对ROS的敏感时期,探讨ROS与哺乳动物早期胚胎体外发育的关系,为提高哺乳动物胚胎体外发育效率,以及为胚胎学、发育生物学和基因工程研究提供可靠的理论依据。
在添加不同浓度过氧化氢的TCM-199培养液中培养兔2-细胞期胚胎实验中,对照组、≥118μmol/L组、103μmol/L组、94μmol/L、≤88μmol/L组的囊胚发育率分别为86%、5%、26%、34%、75%;在确定哪一时期有抑制作用的实验中,0~24h处理组(37.14%)、24~48h处理组(54.29%)与对照组(91.42%)差异显著,48~72h处理(82.86%)与对照组(91.42%)无显著性差异。由于DCFH荧光的强度和EB荧光的强度与H2O2和O2-含量呈线性关系,所以我们用荧光的强度来衡量胚胎内部H2O2和O2-的水平,其结果显示:从4-细胞期到桑椹胚胚胎内部的H2O2和O2-的水平都比较高。不同时间不添加H2O2对兔胚胎体外发育的影响实验,其结果显示:0~24h不处理组(82.26%)与对照组Ⅰ(97.14%)无显著性差异,但与24~48h不处理组(52.50%)和48~72h不处理组(30.00%)有差异,24~48h不处理组(52.50%)和48~72h不处理组(30.00%)之间也有差异。
可以看出:抑制兔2-细胞期胚胎体外发育的最低过氧化氢浓度为94μmol/L。兔2-细胞期胚胎在体外发育时16-细胞之前胚胎对环境中的H2O2都敏感,尤其是8-细胞之前的胚胎对环境中的H2O2更为敏感。