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SUMO (small ubiquitin-related modifier)蛋白是一类与泛素非常类似的小分子蛋白,参与重要的蛋白质翻译后的修饰——SUMO化修饰(SUMOylation)。SUMO化修饰调节机体的一系列生理学与病理学的过程,与很多疾病的发生发展都存在密切的联系,例如炎症性疾病和炎症相关性疾病,包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)。p65是NF-κB家族最重要亚基之一,p65蛋白入核后激活NF-κB信号通路在肝细胞癌的发生发展过程中起重要作用。近年来已有文献证实,在人胚胎肾293T细胞和小鼠3T3纤维细胞中p65蛋白能被外源性的SUMO3蛋白进行SUMO化修饰,但是目前未见p65蛋白与SUMO1、SUMO2蛋白之间相互作用,以及p65蛋白发生SUMO化修饰之后对HCC影响的研究报道。本课题组前期证实MANF (Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic factor,中脑新型胶质细胞源性神经营养因子)能在细胞核内与p65存在相互作用从而抑制NF-κB的转录活性,但是SUMO蛋白是否影响p65与MANF的相互作用,未见报道。目的：研究SUMO蛋白在HCC中如何差异性地调节p65细胞内的水平和定位及是否影响p65与MANF的相互作用。方法：选取乙肝患者及HCC患者的肝组织固定石蜡包埋切片,采用免疫组化的方法在人的肝炎组织、HCC患者的癌组织和癌旁组织中检测p65、SUMO1及SUMO2/3蛋白的表达情况；在人肝癌组织及肝癌细胞株中采用免疫荧光双标检测p65与SUMO1或SUMO2/3是否存在细胞内的共定位现象；在人肝癌组织及肝癌细胞株中采用免疫共沉淀的方法验证p65与SUMO1或SUMO2/3之间是否存在相互作用以及p65蛋白是否能发生SUMO化修饰；Western blot在肝癌细胞株中观察肿瘤微环境(如：缺氧及炎症刺激)对p65蛋白的细胞内亚定位以及SUMO1和SUMO2/3蛋白水平的表达是否有影响；免疫共沉淀实验观察肝癌细胞株行缺氧及炎症刺激处理后p65的SUMO化修饰水平是否产生变化；在肝癌细胞株中转染外源性的SUMO1或SUMO2/3,采用Western blot及核浆分离实验观察p65蛋白水平及细胞内亚定位的变化；通过双荧光素酶报告基因实验检测过表达及沉默SUMO1对NF-κB转录活性的影响；在肝癌细胞株中,采用MTT、克隆形成实验、transwell小室实验观察SUMO1及SUMO2/3对肝癌细胞增殖及侵袭能力的影响,以及在人肝癌组织中行免疫荧光双标检测SUMO1与ki67蛋白之间的相关性,评价SUMO1蛋白是否与肝癌细胞的增殖有关；在肝癌细胞株中分别敲低内源性SUMO1或SUMO2/3,免疫共沉淀实验检测p65与MANF蛋白之间的相互作用是否受SUMO蛋白的影响。结果：1.在人肝组织中观察p65、SUMO1以及SUMO2/3蛋白的表达情况免疫组化结果显示,在肝炎组织中有少量SUMO1阳性表达细胞；肝癌组织中SUMO1表达量明显高于癌旁组织,且定位于细胞核中。SUMO2/3的表达与SUMO1不同,SUMO2/3在肝炎组织中有少量表达,细胞质和细胞核中均有分布；癌组织中SUMO2/3的表达明显低于癌旁组织,主要定位于细胞质中。p65蛋白的表达与SUMO2/3非常类似,肝炎组织中少量表达,癌组织低表达,癌旁组织高表达,但是在肝癌组织的胞核中有p65存在。2. SUMO1与p65的相互作用免疫荧光双标显示p65蛋白与SUMO1在HCC患者的癌组织以及肝癌细胞株中存在共定位的现象,主要共定位于细胞核中。在人肝癌组织及肝癌细胞株中,免疫共沉淀实验也发现SUMO1与p65的相互作用,并发现SUMO1可使p65蛋白发生SUMO化修饰。3. SUMO2/3与p65的相互作用人肝组织连续切片的DAB染色显示,p65蛋白与SUMO2/3的表达高度一致。进一步免疫荧光双标实验发现,p65与SUMO2/3共定位于细胞质中；同时SUMO2/3表达高的细胞中p65表达多,SUMO2/3不表达的细胞中,p65表达很少。在HCC患者的肝组织及肝癌细胞株中,免疫共沉淀实验进一步证实SUMO2/3与p65的相互作用,并发现SUMO2/3可使p65蛋白发生SUMO化修饰。4.缺氧及炎症刺激促进SUMO1和SUMO2/3蛋白的表达及p65的SUMO化肝癌细胞株经过缺糖缺氧处理150 min后可发现有部分p65蛋白入核,SUMO1及SUMO2/3蛋白表达量增加。肝癌细胞株经过TNF-a (10ng/ml)处理30 min,部分p65蛋白入核,细胞质中SUMO2/3蛋白水平明显增多,但SUMO1蛋白的水平没有明显变化。当TNF-a(10ng/ml)处理肝癌细胞株8 hrs时,细胞质中SUMO2/3蛋白的水平与TNF处理30 min时无明显变化,而细胞核中SUMO2/3蛋白水平明显增多,细胞质和细胞核中SUMO1蛋白的水平均明显增高。免疫共沉淀实验结果显示：细胞在转染SUMO化修饰E2酶(Ubc9)及外源性的SUMO质粒后24 hrs,缺糖缺氧处理150min能增加SUMO1蛋白相关的p65的SUMO化修饰水平,但并不影响SUMO2/3相关的p65的SUMO化修饰；细胞转染24 hrs后采用TNF-α(10ng/ml)刺激30 min,能同时增加SUMO1及SUMO2/3蛋白相关的p65蛋白SUMO化修饰水平。5. SUMO1蛋白参与调节p65蛋白的入核肝癌细胞株中过表达SUMO1并不影响p65蛋白水平。核浆分离实验发现,过表达SUMO1能增加缺糖缺氧诱导的p65蛋白入核,相反沉默内源性的SUMO1能抑制p65蛋白入核；同时沉默SUMO1能抑制TNF-α刺激诱导的p65蛋白入核,而过表达SUMO1对TNF-a诱导的p65蛋白入核影响不大。6.敲低内源性SUMO1蛋白抑制NF-κB的转录活性在肝癌细胞株中采用双荧光素酶报告基因实验方法,结果显示：正常培养的细胞以及细胞经过TNF-α刺激或缺糖缺氧处理,过表达SUMO1都能抑制NF-κB的转录活性；而敲低内源性的SUMO1也能抑制NF-κB的转录活性。7.敲低内源性SUMO1抑制肝癌细胞株的增殖与转移侵袭能力MTT、克隆形成实验证实：敲除内源性SUMO1抑制了细胞的增殖能力。于是我们进一步在人肝细胞癌的癌组织中采用免疫荧光双标观察ki67和SUMO1的相关性,发现：所有ki67阳性的细胞,SUMO1都是表达阳性。于是我们推测：SUMO1蛋白的表达可能与肝癌细胞的增殖能力有关。transwell实验显示,过表达SUMO1能增加肝癌细胞株的转移侵袭能力,沉默SUMO1抑制了细胞的转移侵袭能力。8. SUMO2/3稳定胞质中p65蛋白的水平与其拮抗p65的泛素化有关肝癌细胞株中过表达SUMO2/3发现,p65蛋白水平随转染SUMO2/3的DNA增多而增高。进一步核浆分离实验发现,SUMO2/3蛋白主要是维持p65蛋白在细胞质中的稳定性。在肝癌细胞株中过表达SUMO2/3检测p65的mRNA水平,发现SUMO2/3并不影响p65的转录水平。同时免疫共沉淀实验发现,当SUMO2/3蛋白相关的p65的SUMO化修饰增多时,p65蛋白的泛素化减少。该结果提示SUMO2/3蛋白可能是通过拮抗p65的泛素化,减少p65蛋白降解来稳定胞质中的p65蛋白水平。9.过表达SUMO2/3蛋白抑制肝癌细胞株的增殖MTT实验发现,在肝癌细胞株中过表达SUMO2/3抑制了肝癌细胞株的增殖能力,SUMO2/3并不影响肝癌细胞株的转移与侵袭能力。10. SUMO蛋白影响p65与MANF之间的相互作用免疫共沉淀实验发现,在肝癌细胞株中敲低内源性SUMO1或SUMO2/3, p65与MANF蛋白之间的相互作用减少。结论：1. SUMO1和SUMO2/3能与p65相互作用并对其进行SUMO化修饰；2.缺糖缺氧和TNF-α能增强SUMO蛋白与p65的相互作用；3.敲低SUMO1能抑制缺糖缺氧和TNF-α诱导的p65蛋白入核,并能抑制NF-κB的转录活性；4. SUMO2/3能稳定胞质中的p65蛋白水平；5.p65蛋白的泛素修饰拮抗它的SUMO化；6. SUMO1能促进肝癌细胞的增殖与转移侵袭能力；7.过表达SUMO2/3能抑制肝癌细胞的增殖；8.敲低SUMO1或SUMO2/3影响p65与MANF之间的相互作用。