脂质体口服给药具有一定的促进蛋白多肽药物吸收的作用,但普通脂质体在体内容易受到胆盐的破坏,并且难以穿透生物膜,限制了其在口服给药方面的应用。含有胆盐的脂质体,由于胆盐的作用,使脂质体胃肠道的稳定性得以改善,在口服粘膜免疫方面得到很好的应用。本文拟以胰岛素为模型药物,利用胆盐脂质体的促进吸收作用来提高蛋白多肽类药物的口服生物利用度,并对其作用机制进行研究。针对胰岛素在脂质体中包封率低的特点,本文采用逆向蒸发／高压均质法制备胰岛素脂质体,首先以包封率和粒径为指标,对制备方法进行了优化,分别考察了均质压力、均质次数、磷脂／胆盐比、药／脂比、内水相pH、外水相离子强度、初乳相体积比以及水化时间等影响因素。最优处方的胰岛素包封率为30±2%,脂质体粒径为144±18nm。圆二色谱检测结果表明在各种极端制备条件下制备的脂质体,胰.岛素的二级构象保持完好,α螺旋含量和θ0208/θ223值均与胰岛素溶液十分接近；小鼠皮下降糖实验表明,制剂中胰岛素的降糖作用与胰岛素溶液无显著性差异。本文的制备条件对胰岛素的二级构象和生物活性无影响,。在制备工艺优化的基础上,本文分别制备了胰岛素的甘氨胆酸盐脂质体(SGC-liposomes)、牛磺胆酸盐脂质体(STC-liposomes)、脱氧胆酸盐脂质体(SDC-liposomes)和普通脂质体,在体外对其性质进行了表征,正常大鼠和糖尿病大鼠模型上对胆盐脂质体的降糖作用及生物利用度进行了研究。为了逐步揭示胆盐脂质体促进胰岛素口服吸收的机制,本文中首先比较了不含不同胆盐的脂质体、不同粒径大小的脂质体和不同的给药剂量对胰岛素口服吸收的影响。透射电镜观察表明胆盐脂质体的外观为类球形,而普通脂质体则较为圆整,这可能与胆盐脂质体膜柔性大有关。体外6个小时的泄漏实验表明,胆盐脂质体在pH 2,5.6和6.8的环境里比较稳定,泄漏较缓慢,包封率基本不变。圆二色谱检测及小鼠皮下降糖实验表明,包载在三种胆盐脂质体中的胰岛素活性保持完好。大鼠口服三种胆盐脂质体后,都有一定程度的降糖作用,而口服胰岛素溶液、胰岛素与甘胆酸盐的混合液、空白胆酸盐脂质体制剂和胰岛素与空白胆酸盐脂质体制剂则没有降糖作用。比较不同胆盐脂质体的降糖水平发现,以甘胆酸盐脂质体的效果最佳,最大降糖百分数63%,持续降糖20个小时左右。不同粒径的胆盐脂质体达峰时间和药效持续时间不同,小粒子的达峰时间快,但药效持续时间短,大粒子则恰好相反；粒子太大,如2000nm则无降血糖作用。考察不同浓度对降糖效果的影响发现,在2-20 IU／Kg的给药剂量内,降糖效果和血药浓度呈现剂量依赖关系,血糖曲线上面积AAC和药时曲线下面积AUC均与浓度呈正相关,相关系数r≈0.9.糖尿病大鼠口服各个制剂和对照制剂后,降糖作用明显,趋势与正常大鼠相似,其中以甘胆酸盐脂质体的降糖作用最强,最大降糖百分数达55%,持续降糖24个小时左右,PA和F分别为10.2%和9.9%。体外抗酶降解的实验说明,在4小时内,胆盐脂质体能有效保护胰岛素减少胃蛋白酶、胰蛋白酶和α糜蛋白酶对它的降解,效果明显好于普通脂质体。其中以甘胆酸盐脂质体的保护作用最佳,三种酶中4个小时胰岛素存留百分含量分别为最初的48%、67%和81%；随着胆盐在脂质体总脂质中比例的增加,保护作用减弱,这可能与胆盐增加了药物的泄漏有关。大鼠口服近红外探针IR783标记的胰岛素脂质体,在胃肠道存在的时间与抗酶降解能力有关,抗酶降解能力强的,胃肠道存在时间久,入血胰岛素浓度大。甘胆酸盐脂质体在胃肠道内保留时间最久,血药浓度最大,普通脂质体15分钟后即有大量胰岛素被降解。Caco-2细胞对脂质体的摄取可被胆盐大大促进,并且胰岛素有可能是以载药脂质体整体被摄取,空白脂质体和甘胆酸盐本身不能促进细胞对胰岛素的摄取。细胞对胆盐脂质体的摄取与粒径相关,400 nm以下的小粒子细胞摄取量较多,2000 nm的大粒子几乎不被细胞摄取。细胞摄取量还与浓度呈正相关,制剂浓度越高,细胞摄取量越大。胆盐脂质体与Caco-2细胞作用后能迅速打开细胞的紧密连接,并促进胰岛素跨细胞单层转运,显著优于普通脂质体。甘胆酸盐脂质体的渗透系数Papp 4.79±055×10-6是普通脂质体的近3倍。粒径大小对转运有影响,随着粒径的减小跨膜电阻值下降更多,药物累积透过量更大,2000 nm的粒子基本无转运；制剂浓度对细胞的跨膜电阻和Papp影响较小,随着浓度增大,药物累计透过量增加。激光共聚焦显微镜观察胆盐脂质体孵育2h后的细胞,发现肌动蛋白缩短,ZO-1蛋白断裂,而普通脂质体和胰岛素溶液作用后的细胞与正常细胞无明显差别。比较不同胆盐类型和不同浓度的制剂对细胞存活率和凋亡的影响,发现在1～25mM浓度范围内的三种胆盐脂质体,对细胞存活率基本无影响,4个小时MTT实验表明细胞存活率下降很小；Annexin V FITC/PI法检测,制剂对细胞24小时的凋亡诱导率基本为0.初步安全性实验表明,胆盐脂质体对细胞的毒性比较小综上所述,胆盐脂质体作为胰岛素口服递送的载体,能够有效地促进胰岛素的口服吸收,糖尿病大鼠口服生物利用度PA和F分别达到10.2%和9.9%；胆盐脂质体口服后能有效抑蛋白酶活性,保护胰岛素免受降解,在胃肠道滞留时间长；基于Caco-2细胞的实验结果表明胆盐脂质体存在以跨细胞和跨细胞间隙途径被吸收的可能性。