柑橘是我国重要果品之一。近年来我国水果产量全面增长，果品购销迅速从卖方市场转向买方市场，特别是随着我国加入WTO，柑橘将面临市场国际化的激烈竞争，提高柑橘果实品质已是迫在眉睫。含糖量是柑橘果实品质构成的重要指标之一，而且糖是酸、类胡萝卜素和其它营养成分及芳香物质合成的基础原料。而转化酶是蔗糖代谢的关键酶，它包括几种同工酶，参与蔗糖在柑橘果实的源库分配，调控细胞分化和膨大以及发育，决定果实中糖的成分及比例，还参与对机械伤、病菌侵染和寒冷的响应过程等。因此研究柑橘转化酶相关基因具有重要的意义，可以从分子水平理解柑橘果实蔗糖积累与分解的分子机制，为通过基因工程改良柑橘品质和科学调控果实品质奠定基础。 本研究根据GenBank登记的植物液泡和细胞壁转化酶基因序列的保守区设计了4对PCR引物，采用我们改进的滤纸吸附噬菌体—PCR法筛选甜橙久噬菌体文库；分别以温州蜜柑、金柑和酸橙基因组DNA为模板进行PCR获得相关的转化酶基因成员的片段；运用Seq Aid Ⅱ、Clustalx和Bioedit软件包对获得的转化酶基因家族的7个序列进行了同源性分析和聚类分析；对不同成员进行了Southern杂交分析；以金柑、酸橙为材料进行了转化酶基因的特异性表达的初步研究。主要结果如下： 1．从甜橙基因组文库中筛选分离了甜橙液泡酸性转化酶基因全长序列(CS-VI1)，该序列全长6942bp，包括1个类似转录因子、启动子序列、ORF和下游序列，编码588个氨基酸(图4)，该基因包括6个外显子和5个内含子，其中第2个外显子仅9bp，编码3个氨基酸(DPN即天冬氨酸、脯氨酸和天冬酰胺)，是迄今为止在植物界发现的最小的外显子。该基因与植物液泡转化酶基因同源性较高，推测定位于液泡，属于甜橙液泡酸性转化酶基因(CS-VI1)。 2．从甜橙基因组文库中筛选分离了甜橙细胞壁酸性转化酶基因(CS-CWI1)，已测定序列长3073bp，该序列编码281个氨基酸，包括3个内含子和2个外显其中第1个外显子仅9bp，编码DPN(天冬氨酸、脯氨酸和天冬酰胺)，目前该基因的全序列测定正在进行之中。该基因序列与植物细胞壁转化酶基因同源性较高，推测其定位于细胞壁，属于甜橙细胞壁酸性转化酶基因(CS-CWI1)。 浙江大学博士学位论文：柑橘转化 因家族咸员的分离及表达研究（2002） 3．获得了温州蜜柑转化酶基因家族3个基因片段，分析表明分别属于温州蜜 柑液泡转化酶基因工型（n－MI）、温州蜜柑液泡转化酶基因工1型（m－ MZ）和温州蜜柑细胞壁转化酶基因I型（CUC们1）3个不同的成员。此外 还获得了金柑细胞壁转化酶基因片段（FC－CW）和酸橙转化酶基因片段。 4．对获得的上述7个柑桔类转化酶基因序列进行的同源性和聚类分析结果表＿ 明，7个基因序列可分为四种类型：即温州蜜柑液泡转化酶基因CU－An，＿ AFO 14925）和酸橙液泡转化酶基因（CA－Vll，AF434728）属于柑桔液泡转化 酶基因1型，温州蜜柑液泡转化酶基因（CU－AE，AY029481）和甜橙液泡转 化酶基因（“－叮1，吓扮％4幻属于柑桔液泡转化酶基因＊型，温州蜜柑细 胞壁转化酶基因（CU－CWI，AF332881）属于柑桔细胞壁转化酶基因I型、甜 橙细胞壁转化酶基因（CS－CWll，AF314197）和金柑细胞壁转化酶基因（FC— CWI）属于柑桔转化酶基因 11型。 5，DIG－Southern杂交结果表明，四个转化酶基因家族的成员 CU－AI、CU－ AIZ、CU－CWll和“－CWll中，除n－CWll和0－CWll两个探针杂交出现 较弱的杂交干扰信号外，其它各成员之间无干扰信号产生。CU－CWI 和＿ CS－CWll两个探针杂交出现次信号，可采用 CSCWI与 CUCWI同源性较低的 另一段序列制作探针进行杂交来消除，也可通过缩短杂交时间、提高杂交 和洗膜的温度以及降低洗膜SSC的浓度等措施来减弱甚至消除。 6．DIG－Northern杂交结果表明，金柑细胞壁酸性转化酶基因（FC－CWI）在金 柑和酸橙的幼果中特异表达，具有器官特异表达特性。同一基因类型的甜－ 橙转化酶基因（CS－CWI）的阳性克隆已获得，有望得到一个果实特异的启动 子。 7．本研究在文库筛选和基因亚克隆方法上作了改进。滤纸吸附噬菌体PCR是－ 一种快速、灵敏、经济有效的文库筛选方法。利用Tao DNA聚合酶的聚合 活性和3’末端转移酶活性，改变该片段使其含有3’腺苦酸O）突出未端，与＿ pUCm1载体实现了高效连接～。8．初步建立了以柑桔类果树根茎叶花果实为材料的RNA的提取方法，经分析 表明，RNA的质量可满足Northern杂交、RT－PCR等试验的要求。