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在肝脏中,尿素循环（urea cycle,UC）由五种催化酶参与调节:氨甲酰磷酸酯合成酶1（carbamoyl phosphate synthase,CPS1）和鸟氨酸氨甲酰基转移酶（ornithine transcarbamylase,OTC）是线粒体酶,精氨酸琥珀酸裂解酶（argininosuccinate lyase,ASL）、精氨基琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthase,ASS1）和精氨酸酶1（arginase1,ARG1）是细胞质酶。近年来,尿素循环代谢异常与肿瘤发生发展的关系备受关注。越来越多的研究结果表明,尿素循环酶的变化不仅与肿瘤的发生发展有关,还与肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌（colorectal cancer,CRC）等的生存期差有关。胞质鸟氨酸（尿素循环的中间产物）是鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC,也称为ODC1）产生腐胺的特定底物,腐胺、精胺和亚精胺等多胺在肿瘤细胞增殖过程中发挥重要作用。研究结果显示,ODC1活性升高可促进细胞增殖,加速肿瘤细胞的生长;提示抑制ODC1活性或可成为抑制肿瘤的潜在作用靶点。结直肠癌是全球发病率排名第四的肿瘤,虽然近年来其总体发病率有明显下降的趋势,但50岁以下CRC的发病率却持续增加。与此同时,结直肠癌的预后因肿瘤所处阶段的不同而差异巨大,I期患者的5年生存率约为90%,IV期患者仅为5%。尽管60%的患者确诊后具有手术切除的机会,但其中仅有近半患者通过手术切除得以根治,另有20%到25%的患者需要手术切除联合化疗,但往往还面临肿瘤复发、转移的风险。因此,目前临床上CRC的治疗仍以化疗为主;而常用化疗药物如奥沙利铂具有较大的毒副作用,且常发生耐药。因此,研发毒副作用小且治疗效果好的抗结肠癌药物具有重要的临床意义。二甲双胍（metformin,Met）是口服双胍类药物,1994年被美国FDA批准作为治疗糖尿病的一线药物。多项临床研究显示,罹患不同类型肿瘤的糖尿病患者服用二甲双胍后的存活率均有所提高,提示二甲双胍具有潜在的抗癌效果。已有的研究结果发现,二甲双胍作为调节糖代谢的经典药物,可通过AMPK依赖和非依赖途径发挥诱导自噬、抗衰老、抗氧化应激、抗内质网应激、抗炎、抗纤维化等作用,与此同时,二甲双胍诱导的AMPK通路的激活可诱导p53的激活并增强p53的活性。p53基因是最常见的抑癌基因之一。正常条件下,p53严格控制着细胞增殖、衰老、DNA修复和细胞死亡等生理过程。近期的研究结果表明,p53在正常细胞和肿瘤细胞的新陈代谢中也扮演重要角色,其调节功能的异常与糖代谢、氨基酸等代谢改变密切相关,揭示了p53通过调节体内代谢影响肿瘤进展的作用。尿素循环是氨基酸代谢的重要部分,最新的研究显示,p53可通过抑制尿素循环发挥抗肿瘤的作用。二甲双胍抑制结肠癌细胞增殖的作用已有报道而缺乏机制研究;那么,二甲双胍是否通过AMPK/p53信号通路调节尿素循环酶及ODC1活性、抑制结肠癌细胞的增殖尚未见报道。目的本研究第一部分以人结肠癌细胞株HCT116裸鼠体内成瘤模型为研究对象,采用灌胃Met的方式建模,检测Met对肿瘤生长、尿素循环及腐胺生成的影响;第二部分研究以人结肠癌细胞株HCT116、SW480为研究对象,研究Met对结肠癌细胞增殖、尿素循环和腐胺生成的影响,进一步结合Met在体内、外作用探讨其抑制结肠癌细胞增殖的机制,为临床应用Met治疗结肠癌提供新的理论和实验依据。方法第一部分:采用HCT116细胞接种在5周龄雌性BALB/c-nu鼠右下腋窝处皮下成瘤,实验组以浓度为200 mg/kg/day的Met灌胃（Met组）、对照组（Control组）灌胃200μL生理盐水/天,持续28天,每天测量肿瘤体积、重量,待给药处理结束后处死裸鼠,取瘤体称重并拍照。小鼠处死前收集血液采用血液生物化学检测尿素和尿酸;液相色谱-串联质谱（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）检测两组肿瘤组织中尿素循环代谢和腐胺生成水平的差异;生物信息学技术检测ODC1基因和蛋白在正常结肠组织及结肠癌组织中的表达差异;Western blot检测肿瘤组织中AMPK/p53信号通路,尿素循环关键酶和ODC1蛋白表达水平的改变。第二部分:以人结肠癌细胞株HCT116、SW480为研究对象,采用CCK-8法、克隆形成实验检测Met对结肠癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测Met对结肠癌细胞周期的影响;LC-MS/MS检测Met对结肠癌细胞尿素循环和腐胺生成的影响;生物信息学技术检测ARG1,TP53表达与结肠癌患者生存曲线的关系;在两种结肠癌细胞株中检测AMPK及尿素循环酶和ODC1的表达水平;分别以p53激活剂Nutlin-3为阳性对照和p53抑制剂pifithrin-α（pft-α）预处理HCT116细胞再负荷Met后,采用Ed U、克隆形成实验检测上述处理对结肠癌细胞增殖的影响,流式细胞术检测上述处理对细胞周期的影响,Western blot检测p53及ODC1蛋白的表达水平的影响。结果第一部分:1.裸鼠瘤体体积及重量的测量结果显示:与Control组比较,Met组瘤体体积明显减小、重量明显减轻。血液生化结果显示:与对照组相比,Met组小鼠的血尿素、血尿酸水平明显下降,具有统计学意义（P<0.001）;2.氨基酸代谢检测结果显示:与对照组相比,Met组裸鼠肿瘤组织代谢物水平明显改变,腐胺水平明显下降,有统计学意义（P<0.01）;3.生物信息学结果显示:结肠癌患者肿瘤组织中ODC1基因水平较正常结肠组织水平高,正常结肠组织ODC1蛋白免疫组化染色呈无染色或呈浅棕黄色,而结肠癌组织ODC1蛋白呈较强或深棕黄色染色。4.Western blot结果显示:与对照组相比,Met组裸鼠肿瘤组织内AMPK、p53和p21蛋白表达水平升高,尿素循环蛋白CPS1、OTC、ARG1及鸟氨酸脱羧酶ODC1蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。第二部分:1.CCK-8法检测结果显示:Met处理后,HCT116及SW480细胞的增殖受到明显抑制（P<0.05）,且呈时间和浓度依赖性;经计算得出:24 h的IC50分别为40及42 mmol/L;48 h的IC50分别为20及30 mmol/L。2.克隆形成实验结果表明:Met对HCT116及SW480细胞的增殖抑制作用随浓度升高而增强（P<0.001）。3.FCM检测细胞周期结果显示:Met能够诱导HCT116、SW480细胞周期阻滞在G1期（P<0.001）。4.氨基酸代谢结果显示:与Control组相比,经20 mmol/L的Met处理的细胞代谢物水平发生改变,腐胺水平明显下降（P<0.001）。5.生物信息学结果显示:TP53低表达及ARG1高表达与患者预后生存不良有关。6.Western blot结果显示:Met可有效促进HCT116及SW480中AMPK、p-AMPK蛋白的表达,抑制尿素循环ARG1、OTC及多胺生成限速酶ODC1的表达。7.Nutlin-3处理后Ed U染色、克隆形成实验及FCM结果显示:与对照组相比,Nutlin-3及Met处理的HCT116细胞增殖受到明显抑制,细胞周期阻滞于G1期。Western blot结果显示:与对照组相比,Nutlin-3及Met处理的HCT116细胞内p53蛋白表达水平明显上调,ODC1蛋白表达水平明显下调。pft-α处理后HCT116细胞Ed U实验结果显示:与对照组相比,单独使用pft-α对HCT116细胞增殖无明显抑制作用,Met及pft-α与Met联合作用抑制HCT116细胞的增殖;Western blot实验结果显示:Met可逆转pft-α引起的p53抑制,降低ODC1蛋白的表达。结论1.Met可以在体内抑制结肠癌细胞生长,抑制尿素循环及腐胺生成。2.Met可以在体外抑制结肠癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞在G1期,抑制尿素循环及腐胺生成。3.Met可能是通过激活AMPK/p53信号通路、抑制尿素循环及腐胺生成发挥其抑制结肠癌细胞增殖的作用。