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2002年底，在我国广东省最先出现的严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS），也被称为非典型肺炎，随后在全球30多个国家和地区爆发流行，其致病因子于2003年4月被鉴定为一种新的冠状病毒，命名为SARS冠状病毒（SARS-CoV），属于套病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronvirus），是一种球形、有包膜的单正链RNA病毒，主要引起人和动物的呼吸道和肠道疾病，其基因组长约30kb、结构为：5’-帽状结构-复制酶（rep）-刺突糖蛋白（S）-小包膜蛋白（E）-膜糖蛋白（M）-核衣壳蛋白（N）-polyA尾3’。N蛋白包绕着基因组RNA形成核衣壳，核衣壳外是含S、M、E蛋白的脂质包膜。本研究在大肠杆菌表达出了SARS-CoV的结构蛋白和3CLpro蛋白酶，并对其抗原性进行了鉴定；检测了30份SARS患者恢复期血清抗体情况；构建了全长S和N基因DNA疫苗，进行了小鼠免疫试验；还进行了N基因与绿色荧光蛋白的融合表达质粒在COS1细胞和小鼠肌肉细胞的表达试验。该系列研究为了解SARS-CoV的免疫学特点及为发展SARS-CoV感染的诊断、预防和治疗方法有一定参考意义。 一、SARS-CoV结构蛋白与3CLPRO蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗原性分析 合成SARS-CoV的结构蛋白S、N、M、E蛋白基因和蛋白酶3CLpro基因，其中S基因分为4段分别扩增，S300（第14至313位氨基酸残基）、S240（第301至540位氨基酸残基）、S338（557至894位氨基酸残基）、S324（867至1190位氨基酸残基），分别将这些基因片段插入原核表达质粒载体pBV220、pPROEX HTa、pET-2la和pGEX-4T-1，转化到合适的宿主大肠杆菌（DH5 α或BL21／DE3），以热诱导或IPTG诱导目的基因的表达。细菌裂解以后进行SDS-PAGE和Western Blot分析，所用的检测抗体为2份抗SARS-CoV IgG强阳性的SARS恢复期患者的混合血清。SDS-PAGE分析表明，S300、S240、S338、S324、N、M、E及3CLpro重组表达质粒所转化的大肠杆菌均可表达出与预期分子量一致的蛋白条带。Western Blot分析表明，N蛋白的抗原性最强，S蛋白抗原性较强，其中位于S蛋白N端的S300和S240较位于S蛋白中间部分的S338和C端的S324强，M蛋白的抗原性较弱，而E蛋白和3CLpro重组质粒表达产物未见明确的反应条带。虽然原核表达的蛋白可能对其抗原性有一定影响，但试验结果在一定程度说明，SARS-CoV的N蛋白具有很强的免疫原性，其次是S蛋白，而S蛋白的主要抗原决定簇位于其N末端。 用Ni-NTA树脂以亲和层析法纯化在大肠杆菌中表达的N422、S300和S240蛋白，以之包被酶联板，用ELISA法检测经SARS-CoV全病毒裂解液抗原检测为抗第二军医大学硕士论文SARS一CoV IgG阳性的30份SARS患者恢复期的血清，其中25份血清抗N蛋白190阳性，15份血清抗5300蛋白IgG阳性，12份血清抗5240蛋白IgGI泪性。此结果进一步表明，N蛋白对于SARS一CoV感染的诊断具有最重要的意义。虽然有报道其它冠状病毒的S蛋白具有强抗原性，且抗体具有保护性，但本研究的结果提示，SARS一CoV的S抗体在SARS恢复期中的作用需要进一步研究，可能细胞免疫应答也发挥重要作)JJ。二、SARS一CoVS、N蛋白基因疫苗的构建和在小鼠的免疫试验 PCR扩增S基因第l至753nt基因，同时一利用哺乳动物细胞偏爱的密码子合成S墓因第1至753nt基因，分别用绿色荧光蛋白表达的质粒pEGFPNI为载体检测天然基因与合成的基因的表达水平，表明合成的基因的表达水平明显高于天然基因。用PCR分别拼接、扩增得到S基因第1至2058ni的DNA片段和S基因1913至3768nt的DNA片段，利用1924位的Sall酶切位点，将两段基因连接为3768nt的全长S基因，再利用S基因第746nt的Pstl酶切位点，将合成的5753 DNA片段置换到全长S基因中。将该基因插入到真核表达质粒载体pCIDN，构建部分合成的全长S基因表达质粒pcIDN一mFS，肌肉注射接种BALB/c小鼠，每只小鼠注射剂量为100嗯，二周一次，共三次，以注射空载体作为对照。分别以纯化的大肠杆菌重组5300蛋白和SARS一CoV全病毒抗原法检测小鼠血清中的抗SARS一CoV 5 IgG抗体。结果表明，S基因DNA疫苗能在小鼠有效诱导抗SARS一Cov 5 IgG特异性抗体，三次免疫后的小鼠抗体阳转率达75%，但抗体效价总体不高。5300检测的敏感性不及全病毒裂解液，但二者具有相似的特异性。此结果提示，基于质粒或病毒载体在体内表达S蛋白以诱导抗S蛋白抗体具有可行性，对于发展SARS疫苗具有一定参考意义。 将N基因插入到真核表达质粒载体pcl一ne。，得到重组表达质粒pCI一。将pCI-N肌肉注射接种小鼠，检测其增殖反应及分泌的细胞因子取F一Y和IL一4;以重组N蛋白体内冲击小鼠，检测小鼠的迟发型超敏反应。结果表明，N蛋白能在小鼠肌肉细胞内表达，其DNA疫苗能在小鼠有效诱导特异性抗体和CD4+、CDS+T淋巴细胞免疫应答，且免疫应答属于Thl型。将pCI一N转染COSI细胞，细胞裂解液用Westem Blot检测N蛋白的表达，结果有与预期分子量一致的蛋白反应条带。将缺失终止密码子的N基因插入到增强的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFPNI得到重组质粒PN一EGFP，将此质粒转染COsl细胞，转染后10小时即可观察到胞浆分布的绿色荧光;将该