骨肉瘤是骨原发性恶性肿瘤发病率最高的疾病，青少年好发且死亡率高。其恶性程度高、早期肺转移和预后极差。首选治疗方案为保肢手术并加以大剂量化疗；而已发生转移病人则选择化疗治疗，化疗起着重大作用。现今经典骨肉瘤化疗药物为顺铂、甲氨蝶呤和阿霉素等。但因其肝肾毒性、骨髓毒性、耳毒性、外周神经毒性等副作用和耐药问题，制约了其临床上的长期高疗效使用，所以骨肉瘤转移和复发率高居不下。因此，研发新型低副作用和高疗效抗骨肉瘤药物尤为必要。　　研究发现钌类配合物能有效抑制肿瘤细胞生长，具有抑瘤作用强、毒性低、易吸收、易排出且易被肿瘤组织吸收的特点，其中某些钌配合物已经进入临床应用。　　本研究通过合成的新型钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip作用于骨肉瘤细胞系MG-63和HOS，通过体内外实验探讨验证其抗肿瘤作用，为治疗骨肉瘤提供新的思路和理论基础。　　目的:　　1通过观察体外实验新型钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip对人骨肉瘤细胞MG-63和HOS凋亡作用的影响，探讨钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip对人骨肉瘤的抗肿瘤作用和初步机制。　　2建立骨肉瘤皮下荷瘤模型，观察钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip对人骨肉瘤细胞HOS皮下荷瘤增殖的影响，探讨钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip的体内抗肿瘤作用，并为钌(Ⅱ)配合物的临床应用提供药理学依据。　　方法:　　1、体外实验　　1.1 CCK8法检测钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip对人骨肉瘤MG-63、HOS细胞株细胞活性的影响。　　1.2 Hoechst33258荧光染色观察不同浓度钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip对骨肉瘤细胞细胞核的影响。　　1.3 AO/EB荧光染色法观察不同浓度钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip处理骨肉瘤细胞后细胞凋亡形态变化。　　1.4流式细胞术检测不同浓度钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip处理骨肉瘤细胞后细胞凋亡情况。　　1.5流式细胞术检测不同浓度钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip处理骨肉瘤细胞后细胞周期变化。　　1.6 JC-1荧光探针检测不同浓度钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip处理骨肉瘤细胞后线粒体膜电位变化。　　1.7免疫印迹法验证不同浓度钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip处理骨肉瘤细胞后凋亡相关蛋白BCL2、BAX和Caspase3表达变化。　　2、体内实验　　2.1实验分组：①空白对照组：生理盐水；②阳性对照组：顺铂组，3mg/kg；③钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip组：a.低浓度组，1/20 LD50浓度，即1.34mg/kg；b.中浓度组：1/10 LD50浓度，即2.67mg/kg；c.高浓度组：1/5 LD50浓度，即5.35mg/kg。　　2.2模型建立及给药方案：裸鼠右腋下消毒后注射5×107个细胞悬液，24h后根据实验分组腹腔注射给药，连续7天。　　2.3结果监测：瘤块每隔2天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，根据体积=长×宽2/2计算体积，测量体重变化。给药18天后，处死裸鼠测量肿瘤重量和肝肺重量，计算脏器系数评价药物对脏器损害，计算药物抑瘤率：（阴性对照组瘤重量-实验组瘤重量）/阴性对照组瘤重量×100％。　　结果:　　1、钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip抗骨肉瘤的体外实验研究　　1.1体外细胞毒性实验结果显示：钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip能显著的抑制骨肉瘤细胞MG-63和HOS的细胞活性，呈剂量-时间依赖效应；对MG-63细胞的24h、48h和72h的 IC50分别为；>500μM、247.98±34.19μM和7.54±0.41μM；钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip对HOS细胞的24h、48h和72h的IC50分别为：196.5±21.8μM、35.6±2.6μM和22.75±0.44μM。　　1.2 Hoechst-33258染色观察显示：与实验组对比，对照组人骨肉瘤MG-63和HOS细胞胞核完整，着色均匀，荧光弥散；不同浓度钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip处理细胞，染色质凝聚皱缩，着色不规则，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状，呈现细胞凋亡皱缩核碎裂等典型变化，而且与钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip浓度相关。　　1.3 AO/EB荧光染色法观察显示：对照组MG-63细胞和HOS细胞，细胞形态未改变，呈均匀黄绿色荧光；低浓度钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip处理后细胞形态改变，核质体呈绿色或橙色，染色质浓缩或碎裂呈点状。可见坏死细胞呈橙黄色或红色。　　1.4 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡显示：钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能够诱导MG-63和HOS细胞凋亡坏死，并呈剂量相关性。MG-63细胞药物处理后（0、25μM、50μM、100μM）的各组凋亡率分别是5.4±0.38%、9.06±1.88%、11.82±2.74%和17.84±0.48%；HOS细胞药物处理后（0、25μM、50μM、100μM）的各组凋亡率分别是5.35±0.32%、7.18±0.62%、14.04±1.96%和25.93±4.03%。　　1.5流式细胞术检测细胞周期变化显示：钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0、25μM、50μM、100μM）作用于骨肉瘤细胞MG-63和HOS细胞24h后流式细胞仪检测周期变化，钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能起S期阻滞，随剂量增加而S期阻滞效应相应升高（MG-63：0、25μM、50μM、100μM分别为23.16±2.18%、29.36±1.93%、36.45±2.93%和39.62±2.35%；HOS：0、25μM、50μM、100μM分别为31.94±3.83%、38.16±5.32%、41.75±4.4%和41.92±2.6%）；而G0/G1期细胞比例则随浓度增高而逐渐减少（MG-63：0、25μM、50μM、100μM分别为62.79±6.04%、50.59±3.3%、39.93±0.69%和38.4±2.95%；HOS：0、25μM、50μM、100μM分别为53.45±0.87%、48.45±6.45%、40.88±4.95%和37.83±1.83%）；G2/M期变化不明显。　　1.6线粒体膜电位JC1探针法检测结果显示：钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能明显降低骨肉瘤细胞线粒体膜电位。对MG-63细胞，钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0、25μM、50μM、100μM）作用24h，流式细胞仪检测相应药物浓度对应线粒体膜电位降低细胞比例为：8±4.5%、28.9±4.16%、33.46±6.1%和42.83±3.33%，；对HOS细胞，钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0和6.25μM）作用24h，原位装载JC-1探针后荧光显微镜观察，探针荧光从红色向绿色转变明显；钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM和200μM）作用24h，全波长多功能酶标仪检测Green/Red荧光，结果显示与阴性对照相比， Green/Red比值随药物浓度增加而升高：1.03±0.19、1.19±0.2、1.27±0.18、1.33±0.19、1.39±0.21和1.42±0.21。　　1.7免疫印迹法验证不同浓度钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip处理骨肉瘤细胞后凋亡相关蛋白BCL2、BAX和Caspase3表达变化，结果显示：钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip（0、25μM、50μM、100μM）作用于骨肉瘤细胞MG-63和HOS细胞24h，与阴性对照相比，骨肉瘤细胞内抗凋亡蛋白Bcl2表达水平下降，而促凋亡蛋白Bax和Caspase3表达升高。　　2、钌(Ⅱ)配合物dmpNAdpip抗骨肉瘤的体内实验研究　　实验设定空白对照组，低、中、高三个药物浓度组，顺铂为阳性对照组。结果表明:(1)与阴性对照组相比，钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能有效抑制肿瘤体积增大，随浓度增高效果越明显，阳性对照组顺铂效果最强；(2)瘤体称重后结果表明：与阴性对照组相比，钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip组瘤体重量较轻，且随药物浓度增加而降低越明显，阳性对照顺铂组瘤体重量降低最明显，结果与时间-瘤体体积结果一致。瘤体抑制率：低浓度组为10.06%、中浓度组为12.7%、高浓度组为25.26%，顺铂组为29.2%；（3）裸鼠肝脏和肺部称重计算脏器系数表明：与阴性对照组相比，钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip组和阳性对照组没有统计学差异，表明钌配合物无肝肺损害或者损害不明显；（4）裸鼠体重实时监测结果表明，开始给药后，阳性对照顺铂组对裸鼠体重影响较大，有明显的降低体重副作用，而钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip组与阴性对照组体重变化无明显差异，副作用较低。　　结论:　　1钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能体外抑制骨肉瘤细胞增殖和促进凋亡。　　2钌（Ⅱ）配合物dmpNAdpip能体内抑制骨肉瘤瘤体增长，且与顺铂相比副作用更小。