1研究背景河南林州（原林县）是中国，也是世界上食管／贲门癌发病率和死亡率最高的地区。目前食管／贲门癌仍然是该地区肿瘤相关主要死亡原因。中晚期食管／贲门癌预后极差，5年生存率仅10％左右。但是，早期食管／贲门癌5年生存率可达90％以上。然而，由于早期患者缺乏特异症状，临床上首次就诊时90％左右的患者为中晚期。缺乏有效的高危人群预警和早期诊断的生物学指标和方法是造成临床上食管癌患者就诊时间过晚，死亡率高的主要原因。很显然，阐明食管和贲门癌变的分子机制，筛选和确定用于高危人群预警和早期发现的分子指标是降低食管和贲门癌死亡率的重要策略和措施。目前，内镜检查和粘膜活检、组织病理学检查，特别是对高发区无症状居民普查和随访，仍然是发现早期癌和癌前病变患者最有效的手段。但是，内镜普查耗资，耗时，并有一定的不适，不适合在高发区大规模无症状人群中进行普查。我们实验室及其它实验室近年的研究提示：（1）p53-Rb系统变化，是食管和贲门癌变过程中发生频率最高的分子事件；（2）这些分子改变还随病变程度加重而升高；（3）机体对这些分子改变可产生不同程度的自身抗体，这些自身抗体可以在食管／贲门癌和各级癌前病变患者的血中检测到；（4）血清自身抗体水平与组织中相应抗原表达相一致。这些研究结果提示这些分子可能是食管／贲门癌早期发现和高危人群预警的重要分子标志物。本研究是在此基础上，通过检测河南林州食管／贲门癌高发区无症状居民血清中肿瘤相关自身抗体，筛查各级癌前病变和可疑癌患者，并对这些可疑患者进一步做内镜和粘膜活检组织病理学检查，阐明自身抗体检测在食管／贲门癌早期发现和高危人群预警中的应用价值和意义。此外，最近的研究显示肿瘤抑制基因Ras相关区域家族1A（Ras association domain family 1A gene，RASSF1A）单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）改变与甲基化在乳腺癌和肺腺癌的发生中起重要作用，是肿瘤易感性升高的分子基础之一。发生RASSF1A改变的乳腺和肺癌前病变患者癌变率明显高于无RASSF1A改变的患者。根据人类单体型计划最新公布的数据，在我国人群中也存在RASSF1A（Ala133 Ser）多态位点。作者的假设是食管癌和贲门癌有相似的遗传因素，RASSF1A基因遗传变异可能增加食管癌和贲门癌的易感性。但是有关RASSF1A（Ala133 Ser）基因SNP与河南食管和贲门癌高发区易感性的关系研究甚少，因此本研究以河南食管癌和贲门癌高发区人群为对象，探讨RASSF1A（Ala133 Ser）基因SNP与食管癌和贲门癌易感性的关系，为高危人群筛选提供更多理论信息和手段。2材料与方法2．1研究对象对河南林州食管／贲门癌高发区3个自然村的863例无症状居民作流行病学调查和抽血检查。其中男性284人，女性578人，平均年龄55±11岁。流行病学调查前先由当地村干部和乡村医生帮助发放和讲解知情同意书，对同意接受检查的人开始询问病史并进行体检，填写基本信息调查表，包括各种肿瘤的家族史。所有被检者均排除急性感染、过敏、自身免疫性疾病等影响血清蛋白质表达的疾病。另外收集112例食管鳞状细胞癌患者（男68例，平均年龄57±10岁；女44例，平均年龄59±10岁）和116例贲门腺癌患者（男70例，平均年龄55±10岁；女46例，平均年龄60±10岁）的病理标本，患者均来自于2000年至2005年间河南林州食管癌医院收治的食管癌和贲门癌病人。2．2技术路线2．2．1对河南林州食管／贲门癌高发区无症状居民作流行病学调查和抽血检查肿瘤相关自身抗体，自身抗体阳性者进一步作内镜检查，粘膜活检和病理组织学及免疫组化检查。选择与自身抗体阳性者相匹配人数的自身抗体阴性者同样作上述检查。2．2．2对照分析肿瘤相关自身抗体检测对食管癌早期发现和高危人群预警中的应用价值和意义。2．2．3对河南林州食管癌医院收治的食管癌和贲门癌病理标本提取DNA，作RASSF1A（Ala133 Ser）基因SNP分型。选择与肿瘤病人相匹配的河南林州食管／贲门癌高发区无症状居民血中提取的DNA，作同样的RASSF1A（Ala133 Ser）基因SNP分型。2．2．4对照分析RASSF1A（Ala133 Ser）基因SNP与食管癌和贲门癌易感性的关系。2．3实验方法2．3．1血样采集与保存对863例研究对象每例均取空腹静脉血5ml至离心管中，室温下静置30分钟，而后2000转／分离心20分钟，吸取血清每管100μl分装，液氮保存，普查结束后转至-80℃冰箱内储存备用。2．3．2血清自身抗体检测用美国Scripps研究所自行提取和纯化的C-myc、cyclinB1、IMP1、Koc、p16、p53、p62、Survivin共8种抗原对以上血清标本进行检测。采用本实验室已建立的间接酶联免疫吸附试验方法，各包被抗原的稀释终浓度为0.5μg／μl，血样稀释浓度为1：50，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG稀释浓度为1：5000。在Elisa板孔中加入用包被稀释液稀释过的抗原100μl／孔，4℃，过夜（24h以上）。加入稀释后的病人血清100μl／孔，每个样品至少做两次检查，37℃孵育。已知阳性的血清为阳性对照，包被缓冲液为阴性对照。加入稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG 100μl／孔，37℃孵育。加入TMB-过氧化氢尿素显色液，100μl／孔，置37℃避光反应，当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl终止反应，并在Elisa Reader读取OD₄₅₀光密度值。2．3．3血清自身抗体检测结果判定采用Scripps研究所判定方法，即正常血清OPD读数均数±3标准差，即Cut-off值（截断值），读数在此值以上的为阳性，否则为阴性。2．3．4食管内镜检查和粘膜活检对血清学检测8种自身抗体有至少1种阳性者和大致相匹配例数的阴性者进行内镜检查，并常规在食管中1／3段（距门齿30cm～32cm）和下1／3段（食管、贲门交界线上2cm～3cm）和贲门（齿状线下2cm）各取1～2块活检组织，并在肉眼可见的病变处随机取材，必要时进行食管粘膜碘染色和贲门粘膜美蓝染色，在食管不染区和贲门染区取材，所有活检组织均迅速置95％乙醇内固定。常规脱水后石蜡包埋，连续切片9张，每张切片厚5μm，其中1张作HE染色，核实组织病理学诊断，其余8张作免疫组化检查。2．3．5病理组织学和免疫组化检查根据细胞形态和组织结构，将食管上皮分为正常（Normal，NOR），基底细胞过度增生（base cell hyperplasia，BCH），不典型增生（dysplasia，DYS），鳞状细胞癌（Squamous Cell Carcinoma，SCC）。检测食管上皮组织中上述8个相关抗原采用免疫组化法。免疫蛋白阳性反应主要定位于细胞浆或细胞核，为棕黄色或棕褐色，高倍镜下（×40）选取五个视野，无阳性细胞或阳性细胞数＜10％为阴性；阳性细胞数=10％为阳性。2．3．6 DNA的提取采用酚—氯仿法从食管和贲门癌组织和食管癌高发区无症状人群外周血中提取DNA，溶解于TE缓冲液，-80℃保存备用。2．3．7降落式聚合酶链反应PCR体积为25μl，包括：1μl基因组DNA，dNTP（各10mmol／L），10×缓冲液，引物各5pmol，Ex Taq DNA聚合酶1U，以上试剂为TaKaRa公司产品。降落式PCR反应循环参数：94℃预变性5分钟；94℃30s，64℃（-0.3℃／循环）30s，72℃30s，共16个循环；94℃变性30s，56℃褪火40s，72℃延伸40s，20个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。以上反应在GeneAmp PCR system 9700型（美国PE应用生物系统公司）基因扩增仪上进行。2．3．8基因型分析参考序列（chr3-50342222-50353371），引物设计采用primer3软件。共设计了两对引物进行巢式PCR，外侧引物：p1为ATGATTCTGTCTTTCCCTTATCCA，p2为ACCAAACCTTGATAATAGGTTCCA；内侧引物：p1为AAGGCAGTCAGTTTCCAAAGACT，p2为ATGAAGAGGTTGCTGTTGATCTG。第一轮PCR采用外侧引物，进行扩增反应后，产物稀释100作为第二轮PCR的模板。取PCR产物10μl采用限制性内切酶AluI（NEB公司）酶切，37℃水浴，过夜。酶切产物用3％琼脂糖凝胶电泳。以凝胶成像分析仪观察分析电泳结果。RASSF1A外显子3编码第133位氨基酸的密码子为GCT（Ala）或TCT（Ser），当该位点为等位基因G时，该段序列是限制性内切酶AluI的酶切位点。巢式PCR终产物为227bp，其中包含该多态位点。当PCR产物被AluI消化后，Ala／Ala基因型为169bp和58bp的两条带，Ala／Ser基因型为227bp、169bp和58bp的三条带，Ser／Ser基因型则无法切开仍为227bp一条带。2．3．9同源分析利用Clustw程序对大鼠、小鼠、犬、类人猿和猕猴和人类的RASSF1A蛋白序列进行比对，蛋白序列检索自PUBMED，序列号分别为XP₈50255（Canis familiaris，犬）；XP₀01168270（Pan troglodytes，类人猿）；NP₀01032644（Rattus norvegicus，大鼠）；AAK21200（Mus musculus，小鼠）；XP₀01100583（Macaca mulatta，猕猴）；NP₀09113（Homo sapiens，人类）。2．4统计方法计量资料以均数±标准差（（?）±S）表示，配对资料比较采用x²检验。用精确概率法检验对照组人群各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，以判断所选人群是否存在基因型或等位基因的分布偏差，从而确定其对整体人群的代表性。对于相对危险度的估计分析，采用“病例—对照”试验设计，并用非条件logistic回归模型计算比数比（Odds Ratios，OR）及95％可信区间（Confidential Intervals，CI）。所有统计皆采用SPSS13.0统计软件进行分析。以上检验水准均采用a=0.05。3结果3．1肿瘤流行病学情况在接受肿瘤流行病调查的863人中，直系三代亲属中无肿瘤患者621人，占72％。直系亲属中有肿瘤家族史242人，占28％。有肿瘤家族史中的各种肿瘤患病总人数为384人。食管癌人数共298人，占肿瘤总数的78％，贲门癌35人，占9％。其它各种肿瘤包括乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌等共51人，占肿瘤总数的13％。临床发现的食管癌227例（91％）为中晚期。3．2肿瘤相关抗原微阵列检测结果应用酶联免疫测定法共检测391例食管癌高发区无症状居民血清C-myc、cyclinB1、IMP1、Koc、p16、p53、p62、Survivin共8种肿瘤相关抗原的自身抗体水平。结果8个肿瘤相关抗原的自身抗体血清阳性监测指标中，至少有1项呈阳性反应的共79例。IMP1和p53表达率最高，分别为5.6％和4.9％，其次为C-myc（4.4％），p62表达率最低（2.3％）。然而，当采用多个抗原联合检测时，至少有1项呈阳性表达率为20％（79／391），联合检出率明显高于任何单个抗原检出率（P＜0.01）。3．3食管内镜检查结果对131例作食管内镜检查。其中至少一种自身抗体阳性者64例，自身抗体阴性者67例。对比自身抗体阳性组和阴性组内镜检查结果，统计学处理显示自身抗体阳性组的食管上皮组织正常率明显低于自身抗体阴性组（P＜0.01）。随食管癌前病变程度的加重，C-myc、cyclinB1、IMP1、Koc、p16、p53、p62和Survivin至少一种抗体阳性检出病变率呈增加趋势，而且出现多种自身抗体阳性。内镜检查131例中，发现食管正常54例，基底细胞过度增生44例，不典型增生30例。检出早期食管癌2例，且均在自身抗体阳性组。自身抗体阴性组内镜未检出食管癌，但是检出1例贲门癌。3．4免疫组化检查结果对经内镜活检，病理组织学确诊的食管上皮组织，选择自身抗体阴性组和阳性组NOR，BCH，DYS各10例及SCC 2例，分别用8种抗体作免疫组化检查。测得C-myc、cyclinB1、IMP1、Koc、p16、p53、p62和Survivin蛋白在食管上皮组织中的表达及其应对抗体在血清中的变化，62例不同类型食管病变人群中血清抗体阳性共40例次，组织中蛋白表达阳性共77例次，组织中蛋白表达阳性率明显高于血清自身抗体阳性率（P＜0.01）。血清自身抗体与组织中蛋白表达有显著正相关。3．5 RASSF1A（Ala133 Ser）SNP一般特征食管癌病人组、贲门癌病人组与对照组之间性别、年龄构成相似（P＞0.05）。所有标本均成功进行了基因型分型，所有重复分型结果均与原结果相符。经卡方检验，健康对照组RASSF1A（Ala133 Ser）基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.831）。3．6 RASSF1A（Ala133 Ser）SNP与食管癌和贲门癌的关系RASSF1A（Ala133 Ser）SNP的Ala／Ala、Ala／Ser和Ser／Ser基因型频率在食管癌病人组与对照组之间无统计学意义（P＞0.05）。但是，贲门癌病人组与对照组之间有统计学意义（P＜0.05），与Ala／Ala基因型比较，，Ala／Ser和Ser／Ser基因型可能增加发病风险（OR=2.06，95％CI=1.09～3.97），分层比较发现，杂合子Ala／Ser即有增加贲门癌发病风险的倾向（OR=1.76，95％CI=0.91～3.41），Ser／Ser基因型可显著增加贲门癌发病风险（OR=9.01，95％CI=0.99～83.31）。4结论4．1联合应用多种肿瘤相关抗原（C-myc、cyclinB1、IMP1、Koc、p16、p53、p62和Survivin）在食管癌高发区部分无症状人群中可检测出相应的自身抗体。4．2自身抗体阳性组食管上皮组织的癌前病变发生率明显高于自身抗体阴性组（P＜0.01）。4．3组织和血清配对的血清中自身抗体阳性表达与抗原在食管上皮组织中的阳性表达有关联性r=0.479（P＜0.01）。4．4据血清自身抗体检测阳性结果作食管内镜检查，可缩小普查人群，提高食管癌前病变和早期食管癌的检出率。对食管癌高发区高危人群预警和早期发现食管癌有一定意义。4．5 RASSF1A（Ala133 Ser）SNP的Ala／Ala、Ala／Ser和Ser／Ser基因型频率在食管癌病人组与对照组之间无统计学意义（P＞0.05）。但是，贲门癌病人组与对照组有统计学意义（P＜0.05）。杂合子Ala／Ser即有增加贲门癌发病风险的倾向（OR=1.76，95％CI=0.91～3.41），Ser／Ser基因型可显著增加贲门癌易感性（OR=9.01，95％CI=0.99～83.31）。4．6对河南林州3个自然村作流行病学调查，发现食管癌仍然是发病率最高的恶性肿瘤。