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近年来,CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins）技术凭借其简便、高效的特点被广泛运用于研究基因的功能。CRISPR/Cas是在细菌和古菌中进化出来的RNA介导的获得性免疫系统,该系统包含两部分:Cas酶和相应的单引导RNA（Single guide RNA,sg RNA）,sg RNA又由CRISPR RNA（CRISPR RNA,cr RNA）和反式激活cr RNA（trans-activating cr RNA,tracr RNA）融合而成。早期,该技术主要通过基因敲除（gene knock-out,KO）和CRISPR干扰（CRISPR inference,CRISPRi）来研究基因的功能。但是这两种策略存在以下弊端:（1）KO在特定靶位点产生DNA双链断裂（Double strand breaks,DSBs）,后续修复过程会引入小片段插入和删除（Insertions and deletions,Indels）;（2）DSBs可能使基因组重排和m RNA紊乱;（3）CRISPRi则是指sg RNA引导核酸酶失活的Cas9变体（dead Cas9,d Cas9）与靶基因结合通过阻断靶基因的转录起始或者转录延伸抑制基因表达,但是该策略的作用只是短暂的,且不能完全抑制基因表达。胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editors,CBEs）将Cas9切口酶（Cas9 nickase,n Cas9）和胞嘧啶脱氨酶结合起来,可以在基因组上实现C.G-T.A转换。因此CBEs系统可以将基因组上谷氨酸（CAA、CAG）、精氨酸（CGA）和色氨酸（TGG）的密码子突变为终止密码子（TAA,TAG,TGA）使得目的基因功能丧失,该策略被称之为CRISPR-STOP。该策略避免了DSBs的产生又可以彻底的终止基因的表达,弥补了KO和CRISPRi的不足;此外,CRISPR-STOP可以模拟16.2%的与遗传疾病相关的无义突变和32,000个癌症相关的无义突变,对构建模拟疾病的动物模型,研究相关疾病的发生发展与治疗方法具有重要意义。本研究首先在家兔胚胎水平验证了经典的BE3系统介导的CRISPR-STOP策略的可行性,随后用该策略构建了Mstn基因提前终止的家兔模型。在家兔胚胎上该策略的平均编辑效率为75%-87%,F0代基因编辑兔的效率高达96%。在实验过程中我们发现传统的BE3系统需要识别NGG PAM（Protospacer-adjacent motif,PAM）,加之CRISPR-STOP只能作用于特定的几个氨基酸的密码子,这极大的限制了靶向范围,无法模拟很多癌症相关的无义突变。针对靶向范围受限这一问题,我们开发了识别NGN PAM的NG-BE4max、识别N4CC PAM的n Nme2-BE4max和识别NAAN PAM的Spy-mac-BE4max系统,并在家兔胚胎上验证这些系统可以介导CRISPR-STOP策略高效地在靶基因上引入提前终止密码子。NG-BE4max介导的CRISPR-STOP策略在兔胚胎水平的效率为75%-100%,F0代基因编辑兔的效率为49%-97%;n Nme2-BE4max介导的CRISPR-STOP策略在兔胚胎水平的效率为17.3%-52.5%,F0代基因编辑兔的效率为20%-50%;Spy-mac-BE4max介导的CRISPR-STOP策略在兔胚胎水平的效率为28.00%-100.00%,F0代基因编辑兔的效率为100%。虽然CBEs介导的CRISPR-STOP策略可以通过高效的在靶基因上引入提前终止密码子来研究基因的功能和模拟致病突变。但是本课题组之前的研究表明在除第一个外显子外的其余外显子上引入提前终止密码子,会导致相应的外显子跳跃。针对这一问题,本研究提出了一种新的基因沉默的方法CRISPR Start-Loss。该方法利用胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editors,ABEs）将基因起始密码子（ATG）分别突变为ATA、GTG和ACG这3种非起始密码子,阻断基因的翻译起始。除了可以避免提前终止密码子诱导的外显子跳跃外,CRISPR Start-Loss首次将天然精确性高、脱靶编辑少的腺嘌呤碱基编辑器用于基因功能的研究,减少了潜在的脱靶风险;该策略还可以靶向1074个CRISPRSTOP不能靶向的基因,与CRISPR-STOP互为补充。本研究接着在人胚肾293T细胞（Human embryonic kidney 293T Cells,HEK293T）细胞的5个基因（Tyr,Otc,Timeless,Lmna,Pah）中选取了7个位点验证CRISPR Start-Loss的效率。通过脂质体转染BEs和相应的sg RNAs编码质粒的方法,我们证实了在HEK293T细胞中CRISPR Start-Loss的平均编辑效率为11.63%-30.67%。随后我们在家兔胚胎水平选取了四个基因（Otc,Tyrp1,Hbb2,Fgf5）上的7个位点验证了CRISPR Start-Loss的效率。单碱基编辑器和相应的sg RNAs编码质粒经体外转录为m RNA后,通过显微注射转移到家兔胚胎。体外培养胚胎至囊胚阶段,收取单个胚胎。经一代测序鉴定,在家兔胚胎水平CRISPR Start-Loss的平均编辑效率为15.68%-73.50%。在细胞水平和家兔胚胎水平验证了CRISPR Start-Loss策略的效率之后,我们运用该策略构建了Fgf5基因起始密码子突变和Otc基因起始密码子缺失的家兔模型,以观察起始密码子突变对基因功能的影响。通过四个月内野生型（Wildtype,WT）家兔与Fgf5基因起始密码子缺失(Fgf5-/-)家兔的毛长、体重对比,Fgf5基因的m RNA表达量、蛋白表达量对比,我们证实了破坏Fgf5基因的起始密码子导致其m RNA表达显著降低,蛋白表达较WT家兔也显著降低。Otc基因起始密码子突变的家兔较WT家兔m RNA和蛋白表达显著降低,成活率降低、血清血氨升高,部分个体呈现肝脏纤维化的表型。Fgf5和Otc两个基因起始密码子缺失的动物模型,均表现出基因缺失相关的表型,证明了破坏基因的起始密码子可以达到基因沉默的目的。综上所述,本研究在家兔胚胎及动物水平验证了CBEs介导的CRISPR-STOP策略的可行性,并开发了NG-BE4max、n Nme2-BE4max和Spy-mac-BE4max系统,将CRISPR-STOP的靶向范围扩大至富含NG序列、富含C序列和富含A序列的位点处。为了弥补CRISPR-STOP诱导外显子跳跃这一弊端,本研究提出了一种新的基因沉默的策略—CRISPR Start-Loss,该策略利用碱基编辑器破坏基因的起始密码子达到基因沉默的目的。我们在HEK293T细胞和家兔胚胎水平验证了CRISPR Start-Loss的可行性,并构建了fgf5基因起始密码子缺失的家兔模型和Otc基因起始密码子缺失的家兔模型证明了CRISPR Start-Loss策略是一种高效、可行的基因沉默方法,可以与CRISPR-STOP互为补充。