细点圆趾蟹产组胺菌检测与控制及其加工下脚料利用

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细点圆趾蟹(Ovalipes punctatus)是东海蟹类中资源密度最高、群体数量最大一种中型食用蟹,但其加工利用存在以下问题,一则在捕捞储运过程中极易腐败,体内高含量游离组氨酸在组氨酸脱羧酶作用下发生脱羧反应而生成大量组胺,为细点圆趾蟹及其产品安全食用带来隐患;二则加工过程中汁液流失严重、采肉率低、残肉较多,大量下脚料目前尚未得到有效利用,导致开发成本高、资源浪费以及环境污染。为此,控制细点圆趾蟹组胺含量,并对其下脚料进行综合开发和利用具有重要现实意义。本论文探讨了细点圆趾蟹组胺生成原因及其控制方法,详细研究了细点圆趾蟹下脚料酶解产物中抗氧化肽与鲜味肽,通过合成肽验证其功能特性,以期为细点圆趾蟹综合开发和利用提供理论基础和技术支持。对鲜活细点圆趾蟹鳃丝和肠中产组胺菌进行筛选和分离鉴定,并对温度、初始pH值、NaCl含量对产组胺菌生长和组胺生成量的影响以及壳低聚糖(COS)对其抑制效果进行了研究。从鲜活细点圆趾蟹鳃条中分离获得1株产组胺菌,经形态学和16S rDNA序列分析鉴定并命名为Enterobacter aerogenes OP-G2,其组胺生成量为46.96±1.94mg/L(30℃培养48h)。低温(<4℃)和/或高NaCl含量(≥10%)能有效控制E.aerogenes OP-G2菌株的生长和组胺生成量,对菌株组胺生成量的抑制率可高达92%以上。COS浓度≥0.5%时,对E.aerogenes OP-G2菌株抑菌率均在30.58%以上,而当pH 6.0时,1%浓度COS对E.aerogenes OP-G2菌株抑菌率高达47.56%。对细点圆趾蟹组胺生成及其影响因素进行了研究,结果表明,细点圆趾蟹是产组胺菌生长及其组胺生成良好的营养来源,20℃下贮藏48h细点圆趾蟹组胺生成量高达179.95mg/kg。在腐败细点圆趾蟹中分离鉴定出1株产组胺菌,经鉴定命名为Enterobacter aerogenes OP2-56,37℃培养48h其组胺生成量达147.61mg/L。进一步分析了贮藏条件、初始pH值和NaCl浓度对接种到新鲜细点圆趾蟹肉与蟹肉汤培养基(OPI)中的E.aerogenes OP2-56菌株生长与组胺生成量的影响,结果表明冰/冷藏(≤4℃)和高浓度NaCl(≥10%)能有效抑制E.aerogenes OP2-56菌株在细点圆趾蟹肉和OPI培养基中生长和组胺生成,其组胺生成量抑制率高达97%以上。这些结果表明捕捞后细点圆趾蟹快速冷却且储运温度≤4℃或采取≥10%NaCl腌制可有效控制其组胺超标的方法。以10%磷酸三钠(TSP)浸泡10min联合5.0%鱼精蛋白喷洒处理含菌蟹样品,研究其对10℃贮藏4d的细点圆趾蟹中产组胺菌和组胺形成抑制作用。结果表明,与NaCl-无菌水处理组相比,TSP与鱼精蛋白单独和联合处理显著抑制蟹肉中产组胺菌生长及其组胺生成,其中TSP与鱼精蛋白联合处理抑制最为显著,其对产组胺菌生长和组胺生成抑制率分别为37.72%和72.92%,这表明TSP与鱼精蛋白联合处理对蟹肉中产组胺菌生长及其组胺生成抑制具有协同作用。TSP与鱼精蛋白联合处理提高了细点圆趾蟹中总磷含量,总磷最大增加量为106.01mg PO43-/100g,但远低于GB 2760-2014所规定的安全限量,表明TSP与鱼精蛋白联合处理可作为抑制蟹肉组胺蓄积的一个安全有效方法。为快速测定海产鱼类组胺含量,建立了一种以硅胶G60为薄层板,丙酮:氨水=95:5为展开剂,上行展开6cm(展开时间≤15min),1.0mol/L NaOH乙醇(80%)溶液和偶氮试剂为显色剂的组胺TLC-图像分析测定方法。结果显示,在1001200ng/点范围内,组胺平均峰面积与组胺质量的标准工作曲线方程为Y=10.440X+1872.235,相关系数Adj.R2=0.9987,检出限和定量限为25.84mg/kg和78.31mg/kg,该方法精密度为1.072.76%,准确度为1.766.22%,回收率为93.7898.24%。同时,在10×20cm薄层板上可以同时检测1015个样品量。该方法可适用于普通水产加工企业与地方市场监督部门对高组胺含量鱼类中组胺检测。为进一步开发利用细点圆趾蟹下脚料,采用胰蛋白酶水解细点圆趾蟹含肉下脚料制备富含抗氧化肽的酶解物,通过超滤、凝胶层析、半制备型RP-HPLC和UPLC-ESI-TOF-MS/MS对其抗氧化肽进行分离纯化与鉴定,并通过合成多肽对其抗氧化能力进行验证。结果表明,酶解产物中分离纯化鉴定出两个ABTS+?清除能力较强的肽段,其氨基酸序列分别为Tyr-Glu-Gly(YEG)和Tyr-Glu(YE)。合成肽YEG和YE的分子量分别为367.35u和310.30u,纯度分别为98.52%和98.04%,清除ABTS+?的IC50值分别为0.456mg/mL和0.184mg/mL,且YE清除ABTS+?的IC50值比L-还原型谷胱甘肽高出30.30%。为进一步开发利用细点圆趾蟹下脚料,采用胰蛋白酶和风味酶分步水解细点园趾蟹下脚料制备鲜味肽,对经超滤与凝胶层析分离获得鲜味组分中游离氨基酸、核苷酸及其关联物和矿物质含量进行分析,从而确定多肽对其呈味特性的作用。在此基础上,采用半制备型RP-HPLC和UPLC-ESI-TOF-MS/MS对鲜味肽结构进行分离纯化与鉴定,通过合成肽验证其呈味特性。结果表明,经超滤和凝胶层析获得组分P3鲜味最高,且多肽(<1kDa)对其鲜味起着主要作用,最终获得两个鲜味较高的肽段,其氨基酸序列分别为Glu-Lue-Ser(ELS)和Trp-Asp-Asp-Met(WDDM),鲜味阈值分别为MSG的1.5和0.85倍;合成肽ELS和WDDM的分子量分别为347.36u和565.59u,纯度分别为97.93%和98.42%,鲜味阈值分别是MSG的2.6和1.1倍,是对应天然肽鲜味阈值的1.7和1.3倍。
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